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May 27, 2024

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 474 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Für die Herstellung von Kryo-Lamellen aus gefrorenen nativen Proben zur Untersuchung mittels In-situ-Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) wurde die Kryo-fokussierte Ionenstrahl-Frästechnologie (Kryo-FIB) entwickelt. Allerdings ist die Präzision des interessierenden Ziels immer noch einer der größten Engpässe, die die Anwendung einschränken. Hier haben wir ein kryokorrelatives Licht- und Elektronenmikroskopiesystem (Kryo-CLEM) mit dem Namen HOPE-SIM entwickelt, indem wir ein 3D-Strukturbeleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopiesystem (SIM) und einen verbesserten Hochvakuumtisch integriert haben, um effizient gezieltes Kryo-FIB zu erreichen. Mit der 3D-Superauflösung von Kryo-SIM sowie unserer Kryo-CLEM-Software 3D-View kann die Korrelationsgenauigkeit der Zielregion von Interesse bis zu 110 nm erreichen, was für die anschließende Kryo-Lamellenherstellung ausreicht. Wir haben das HOPE-SIM-System erfolgreich zur Herstellung von Kryolamellen eingesetzt, die auf Mitochondrien, Zentrosomen von HeLa-Zellen und das Herpesvirus-Assemblierungskompartiment infizierter BHK-21-Zellen abzielen, was auf die hohe Wirksamkeit des HOPE-SIM-Systems für zukünftige In-situ-Kryo-ET schließen lässt Arbeitsabläufe.

Die Aufdeckung dreidimensionaler (3D) zellulärer Ultrastrukturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis des Lebens. In den letzten Jahren wurde die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zunehmend verbessert und entwickelt sich zu einer der wichtigsten biophysikalischen Techniken zur Untersuchung hochauflösender 3D-Strukturen makromolekularer Komplexe1. Darüber hinaus hat sich die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) als weiteres leistungsstarkes Werkzeug zur Visualisierung der makromolekularen Organisation ungestörter Zelllandschaften mit dem Potenzial erwiesen, eine nahezu atomare Auflösung zu erreichen2,3,4. Um die subzelluläre Ultrastruktur in vitrifizierten Zellen durch Kryo-ET sichtbar zu machen, wurde fokussiertes Ionenstrahlfräsen unter kryogenen Bedingungen (Kryo-FIB) verwendet, um dünne Kryolamellen aus vitrifizierten Zellen herzustellen, was viele spannende biologische Beobachtungen im Inneren von Zellen ermöglicht. Die dreidimensionale Organisation zellulärer Organellen wie des Zytoskeletts5,6,7,8,9, des endoplasmatischen Retikulums (ER)10 und des 26S-Proteasoms11 wurde erfolgreich durch Kryo-ET analysiert.

Es gibt mehrere Einschränkungen, die eine breitere Anwendung der Kryo-ET ausschließen, darunter Schwierigkeiten bei der Lokalisierung und Identifizierung interessierender Merkmale12. Die kryokorrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (Kryo-CLEM)13,14,15,16,17,18 hat sich als wirksamer Ansatz zur Überwindung dieses Problems erwiesen, indem sie mithilfe der Fluoreszenzmarkierung zum Ziel für die anschließende Kryo-FIB navigiert Mahlen von vitrifizierten Zellen14,15,16,17 oder Kryo-ET-Bildgebung von gefrorenen, hydratisierten Schnitten12,18. In Anbetracht der Tatsache, dass die normale Dicke von Zellen weit über der mittleren freien Weglänge von 300 keV-Elektronen liegt, ist vor der Kryo-ET-Datenerfassung die Herstellung vitrifizierter Zellen mit einer Dicke von ~200 nm erforderlich. Daher ist das sequentielle experimentelle Verfahren aus Vitrifikation, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie (Kryo-FM), Kryo-FIB und Kryo-ET zu einem routinemäßigen Arbeitsablauf für viele ortsspezifische In-situ-Strukturstudien geworden12,19,20,21,22, 23. Dieser Arbeitsablauf erfordert normalerweise ein eigenständiges Fluoreszenzmikroskop mit einem Kryotisch für die Kryofluoreszenzbildgebung15,16,17,24,25, gefolgt von Kryo-Rasterelektronenmikroskopie (Kryo-REM). Es wird eine Korrelationsausrichtung zwischen den Kryo-FM- und Kryo-SEM-Bildern erstellt und zur Führung des Kryo-FIB-Fräsens verwendet12,18,21,26. Darüber hinaus sind für die Korrelationsausrichtung unter Verwendung spezieller 3D-Korrelationssoftware spezifische Referenzmarker erforderlich, die sowohl von Kryo-FM als auch von Kryo-FIB abgebildet werden, wie z. B. fluoreszierende Perlen21,27. Es wurden viele Hardware-Implementierungen gemeldet, um diesen Arbeitsablauf durch die Entwicklung der kryogenen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie13,21,22 oder der hochauflösenden konfokalen Kryo-Airyscan-Mikroskopie (CACM)12 zu realisieren.

Die Korrelationsgenauigkeit und Erfolgsrate zwischen Kryo-FM und Kryo-FIB wird durch die Auflösung von Kryo-FM begrenzt und durch die Faktoren Probenverformung, Entglasung und Eiskontamination weiter abgeschwächt7,21. Wir haben zuvor eine einzigartige optische Hochvakuumplattform für Kryo-CLEM (HOPE)25 entwickelt, die einen integrativen Kryohalter und eine spezielle Vakuumkammer nutzte, um die Eiskontamination zu minimieren und das Risiko einer Probenverformung und Entglasung während der Kryo-FM-Bildgebung zu verringern Probentransfer. Allerdings hat die Verwendung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops mit einer Objektivlinse mit niedriger numerischer Apertur (NA) und ohne die Informationen über die Z-Position fluoreszierender Ziele in unserem HOPE-System die Korrelationsgenauigkeit auf über einen Mikrometer begrenzt, was verbessert werden muss um die Erfolgsquote des ortsspezifischen Kryo-FIB-Fräsens zu erhöhen.

Bei der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) wird strukturiertes Beleuchtungslicht auf das Bildziel gebracht, was zu niederfrequenten Interferenzstreifen führt, die Strukturinformationen über die Beugungsgrenze des Systems hinaus übertragen, was die Auflösung herkömmlicher Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verdoppelt und die Visualisierung von ermöglicht detaillierte molekulare Prozesse in der gesamten Zelle5,28,29. Im Vergleich zu anderen hochauflösenden FM-Techniken wie der photoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie (PALM)30, der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM)31, der STED-Nanoskopie (Stimulated Emission Depletion)32 und der 4Pi-Mikroskopie33 verwendet SIM eine relativ geringe Beleuchtungsleistung (10–100 mW cm−). 2) und erfordert keine speziellen Fluorophore oder Objektivlinsen, um die beugungsbegrenzte Auflösung in drei Dimensionen zu verdoppeln28,34,35,36,37,38. Die geringe Beleuchtungsleistung minimiert den Erwärmungseffekt auf die Probe, was wichtig ist, um das Risiko einer Entglasung39,40 bei gefrorenen, hydratisierten Proben zu vermeiden. Daher wurde SIM kürzlich in der korrelativen Mikroskopie mit der weichen Röntgenmikroskopie eingesetzt, um Zellen im Glaskörpereis sichtbar zu machen35.

In dieser Arbeit haben wir ausgehend von unserem zuvor entwickelten HOPE-System25 ein Kryo-korrelatives Licht- und Elektronenmikroskopiesystem (Kryo-CLEM) mit dem Namen HOPE-SIM entwickelt, um effizient gezielte Kryo-FIB zu erreichen. Wir haben das Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop auf ein 3D-SIM-System aufgerüstet, um die FM-Bildauflösung in der x- und y-Dimension zu erhöhen und zusätzliche Informationen in der z-Dimension zu erhalten, was die Korrelationsgenauigkeit zur Steuerung der ortsspezifischen Kryo-FIB-Herstellung erheblich verbessert . Wir haben auch das Hochvakuumsystem verbessert, um das Vakuum der Kammer zu verbessern und die Eiswachstumsrate weiter zu reduzieren, was eine längere Zeit der Kryo-FM-Bildgebung ermöglicht, bevor die Probe gefrostet wird. Wir haben auch eine spezielle 3D-Korrelationssoftware, 3D-View, entwickelt, um die markenbasierte Korrelation zwischen Kryo-SIM- und Kryo-FIB-Bildern durchzuführen, die zur genauen Navigation beim Kryo-FIB-Fräsen verwendet wird.

Wir haben die Präzision der Zielregion gemessen, die bis zu 110 nm betragen kann. Und wir haben den auf HOPE-SIM basierenden Kryo-CLEM-Workflow erfolgreich angewendet, um auf Mitochondrien, das Herpesvirus-Assemblierungskompartiment infizierter BHK-21-Zellen und Zentrosomen von HeLa-Zellen abzuzielen.

Unser HOPE-SIM-System (Abb. 1 und 2a, ergänzende Abbildung 1 und ergänzender Film 1) wurde von unserem zuvor entwickelten HOPE-System 25 aktualisiert. Zunächst wurde eine größere Hochvakuumkammer entworfen und auf einem kommerziellen Epi-Fluoreszenzmikroskop (z. B. Modell IX73, Olympus Corporation, Japan) mit einer trockenen Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur (NA) und großem Arbeitsabstand (z. B. Nikon CFI TU) montiert Plan Apo EPI ×100, NA/WD: 0,9/2 mm) in der Kammer montiert. Durch die Platzierung der Objektivlinse in der Vakuumkammer kann eine Linse mit hoher NA verwendet werden, um die FM-Auflösung zu erhöhen. Wie bei unserem vorherigen Design ist ein Vakuumtransfersystem mit einer Vorpumpvorrichtung über einen Balgschlauch und ein manuelles Absperrventil mit der Vakuumkammer verbunden, was den Transfer eines handelsüblichen Kryohalters in die Vakuumkammer und die Kryoprobe ermöglicht oberhalb der Objektivlinse im Lichtweg zu platzieren. Die Bewegung des Kryohalters wird von einem dreiachsigen Elektromotortisch angetrieben, der an der Vakuumkammer befestigt ist. Im Gegensatz zu unserem HOPE-System wurde ein eingebautes Antikontaminationssystem (ACS) entwickelt, das einen Dewar mit flüssigem Stickstoff in der Vakuumkammer fixiert, um eine Kryobox zu kühlen (Abb. 2a und ergänzende Abb. 1b). Diese Kryobox mit einer Arbeitstemperatur von weniger als –175 ° C wird verwendet, um die Spitze des Kryohalters einzuschließen (ergänzende Abbildung 1c – e) und die Kryoprobe vor Eisablagerung/Kontamination zu schützen. Darüber hinaus sind auf der linken Seite der Vakuumkammer zwei Anschlüsse vorgesehen, wobei ein Anschluss mit einem Turbopumpensystem (TPS) und ein anderer mit einem Vakuummeter verbunden ist (ergänzende Abbildung 1a, b). Ein Hochleistungs-TPS wird verwendet, um unter kryogenen Bedingungen ein verbessertes Vakuum von besser als 5 × 10−5 Pa zu erreichen. Wir haben ein Touchscreen-Gerät entwickelt, um die Vakuumniveaus sowohl der Kammer als auch des Absperrschiebers, den Pumpstatus und die Temperatur der Kryobox zu überwachen (ergänzende Abbildung 1a). Um das System um die Objektivlinse in der Kammer zu überwachen, haben wir ein Beobachtungsglasfenster vor der Kammer entworfen (ergänzende Abbildungen 1a, b, e). Damit das Licht durch die Vakuumkammer gelangen kann, sind oben und unten an der Objektivlinse zwei optische Glasfenster angebracht (ergänzende Abbildung 1f, g).

Verglaste Zellen auf EM-Gittern sind zu dick, um direkt mit Kryo-EM abgebildet zu werden. Dem Blindfräsen mittels Kryo-FIB fehlt die Präzision, um auf die Region of Interest (ROI) zu zielen, die durch Kryo-CLEM gelöst werden muss. Die vitrifizierten Zellen wurden zunächst mit Kryo-FM abgebildet und mit guten Fluoreszenzsignalen gescreent. Die Fluoreszenzbilder sowohl der Mikrosphären (blau) als auch der ROIs wurden aufgenommen. Die Fluoreszenzbilder werden dann mit Kryo-FIB-Bildern korreliert, indem die Positionen der Mikrokügelchen ausgerichtet werden (Fiducial-Marker-Registrierung). Die genaue Korrelation wird dann verwendet, um das genaue Kryo-FIB-Fräsen zu steuern und Ziel-Kryolamellen des ROI für die anschließende In-situ-Kryo-ET-Studie vorzubereiten. Ein Beispiel mit Kryo-SIM des HOPE-SIM-Systems zur Demonstration des gesamten Arbeitsablaufs von Kryo-CLEM ist in den rechten Panels dargestellt. Für diese Demo wurden mit MitoTracker Red CMXRos (roter Kanal) gefärbte HeLa-Zellen verwendet. Die fluoreszierenden Mikrokügelchen wurden im grünen Kanal abgebildet und mit dem Kryo-FIB-Bild korreliert, wo die Mikrokügelchen mit Kreuzen markiert sind. Mithilfe der 3D-Korrelation wurde ein genaues Kryo-FIB-Fräsen durchgeführt, und die anschließende Kryo-ET-Rekonstruktion zeigte die Position der Zielmitochondrien in situ.

a Schematischer Überblick über das HOPE-SIM-Systemdesign im Betriebsmodus. Jeder Teil des Systems ist beschriftet und im Text beschrieben. Über den Hintergrundbeleuchtungseinlass wird ein strukturierter Beleuchtungsstrahl in das Mikroskop eingeleitet. TPS-Turbopumpensystem, ACS-Antikontaminationssystem, dichroitischer DM-Spiegel, SIM-Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, SLM-Raumlichtmodulator, HWP-Halbwellenplatte, PBS-Polarisationsstrahlteiler. b Diagrammatische (oben) und reale (unten) entsprechende Teilbilder der Kryo-SIM-Beleuchtungsmuster (schwarz und weiß) auf den Fluoreszenz-Mikrokügelchen (blau). c Vergleiche von Fluoreszenzbildern von 1-μm-Mikrokügelchen in verschiedenen Bildgebungsmodi: Weitfeld (WF), Dekonvolution und Kryo-SIM. Es ist klar, dass Kryo-SIM das Bild mit der besten Auflösung sowohl in der XY- als auch in der YZ-Ebene liefert.

Um zu vermeiden, dass das Gitter bei der anschließenden Kryo-FIB und Kryo-ET direkt berührt wird, haben wir FEI AutoGrid für den Kryo-Probentransfer während des gesamten Kryo-CLEM-Arbeitsablaufs ausgewählt. Ein Kryohalter mit einer Neigung für mehrere Proben (Modell 910.6, Gatan, USA) wurde verwendet, um die Kryoprobe in die Vakuumkammer zu überführen und den kryogenen Zustand während der Kryo-FM-Bildgebung aufrechtzuerhalten. Um AutoGrid mit diesem kommerziellen Kryohalter auszustatten, haben wir unsere zuvor beschriebene Halterspitze 41 (Ergänzungsabbildung 1c, d) verwendet, um AutoGrid mit unseren D-förmigen Suchgittern 42 (Ergänzungsabbildung 1c) montiert zu halten. Diese spezielle Halterspitze ist wichtig, um Kryoproben vor Beschädigungen zu schützen und genügend mechanische Stabilität für die anschließende Kryo-FM-Bildgebung zu gewährleisten.

Neben der Modernisierung des Vakuumsystems und der Mechanik haben wir auch das Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop unseres HOPE-Systems auf SIM (Abb. 2 und ergänzende Abb. 2) aufgerüstet, das eine Laserquelle mit drei Kanälen (561 nm/488 nm) verwendet /405 nm) und einem räumlichen Lichtmodulator (SLM, QXGA-3DM, Forth Dimension Displays) zur Erzeugung eines strukturierten Beleuchtungsmusters. Die resultierenden Fluoreszenzsignale werden vom Objektiv gesammelt und auf einer hochempfindlichen sCMOS-Kamera (Prime 95B, Photometrics) aufgezeichnet. 3D-SIM-Rohdaten können gewonnen werden, um einen Stapel von Fluoreszenzbildserien zu rekonstruieren, die für die anschließende Korrelation und Kryo-FIB-Navigation verwendet werden.

Um das gesamte System (Laser, SLM, Tisch und Kamera) von HOPE-SIM zu steuern und mit der anschließenden Korrelation kompatibel zu sein, haben wir eine auf LabVIEW (National Instrument, USA) basierende Software entwickelt, HOPE-SIM View (ergänzende Abbildung 3). ). HOPE-SIM View kann verwendet werden, um Kryo-FM-Bildgebungsparameter (z. B. Belichtungszeit und Fokussierungszone) einzurichten, den Bereich des gesamten Gitters abzubilden, die Liste der interessierenden Ziele zu registrieren (ergänzende Abbildung 3a) und die Belichtung einzustellen Zeit (ergänzende Abbildung 3b), ändern Sie den Laserkanal und die Leistungsintensität (ergänzende Abbildung 3c), steuern Sie die Bühnenbewegung (ergänzende Abbildung 3d) und sammeln Sie Mehrkanal-3D-SIM-Rohdaten.

Mit unserem HOPE-SIM-System können wir die Kryo-SIM-Bildgebung in das aktuelle Standardprotokoll von Kryo-CLEM integrieren (Abb. 1). Im Detail wird das D-förmige Findergitter verwendet, um Zellen auf eine geeignete Dichte zu züchten, und die Zellen werden dann entweder transfiziert, um fluoreszierend markierte Zielmoleküle zu exprimieren, oder mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt. Vor dem Tauchgefrieren wird der Kultur auf dem Gitter eine angemessene Menge verdünnter fluoreszierender Mikrokügelchen mit einer empfohlenen Größe von 1 Mikrometer Durchmesser zugesetzt. Das verglaste Gitter wird dann in AutoGrid zusammengebaut und in unsere speziell entwickelte Spitze montiert, die für die anschließende Kryo-SIM-Bildgebung in den Cryo-Multi-Halter eingesetzt wird. Insbesondere sollte die Seite des Gitters mit den wachsenden Zellen zur Objektivlinse zeigen.

Vor der Kryo-SIM-Bildgebung muss die Vakuumkammer des HOPE-SIM-Systems auf ein Hochvakuum von ~5 × 10−5 Pa gepumpt werden und das ACS muss mit flüssigem Stickstoff auf weniger als –170 °C gekühlt werden ist wichtig, um die Eiswachstumsrate während der Kryo-SIM-Bildgebung zu reduzieren (ergänzende Abbildung 4 und ergänzende Daten 1 und 8). Der Kryo-Multihalter wird dann über das Vakuumtransfergerät in das HOPE-SIM-System eingeführt. Nach ca. 5 Minuten Wartezeit, um das Vakuum der Kammer wiederherzustellen, und weiteren ca. 5 Minuten, bis sich die Temperatur der Halterspitze stabilisiert hat, ist der Verschluss des Kryo-Multihalters geöffnet und bereit für das Probenscreening und die Kryo-SIM-Bildgebung . Das gefrorene Gitter wird zunächst im Transmissions-Weitfeld-Bildgebungsmodus durchleuchtet und die Konzentration der Zellen, die Positionen der Zellen im Quadrat, die Integrität des Trägerfilms, die Eiskontamination und die Dicke der Probe überprüft. Die Regionen mit Zellen, die an der richtigen Position im Quadrat ein gutes Fluoreszenzsignal, einen intakten Trägerfilm, eine angemessene Eisdicke und gut verteilte Fluoreszenzkügelchen zeigen, werden ausgewählt und als ROIs (Regions of Interest) in HOPE-SIM View für registriert die anschließende 3D-Kryo-SIM-Datenerfassung. Das Sichtfeld des HOPE-SIM-Systems, etwa 140 Mikrometer, deckt genau ein ganzes Quadrat eines 200-Mesh-Gitters ab. Und die Mehrkanal-3D-Bildgebung ermöglicht es, sowohl Referenzmarker als auch fluoreszierende Zielmoleküle zu erfassen.

Nach der Kryo-SIM-Bildgebung wird das mit AutoGrid zusammengesetzte gefrorene Gitter über unser zuvor entwickeltes Protokoll und den Kryo-Shutter42 in ein Dual-Beam-Kryo-REM (z. B. FEI Helios NanoLab 600i) übertragen. Wir haben die auf LabVIEW (National Instrument, USA) basierende Software 3D-View (Ergänzungsbild 5) für die Bildkorrelation zwischen verschiedenen Mikroskopen entwickelt (Ergänzungsfilm 2). Zunächst wird das gesamte Gitter durch Kryo-FIB-Bildgebung bei geringer Vergrößerung durchleuchtet und die Positionen der ROIs können über den Index des Finders ermittelt werden. Die ROIs mit Zellen mit guter Form und geeigneter Dichte werden für die anschließende Kryo-FIB-Bildgebung mit einer geeigneten Vergrößerung von × 2500 ausgewählt (ergänzende Abbildung 5a, b). Zweitens werden die Positionen der fluoreszierenden Perlen sowohl aus dem Kryo-SIM als auch aus den entsprechenden Kryo-FIB-Bildern für eine präzise Korrelation mithilfe der 3D-Ansicht ausgewählt (ergänzende Abbildung 5b) (der detaillierte Algorithmus ist unter Methoden beschrieben). Nach der Bildkorrelation können der optimierte Euler-Winkel und die minimierte Standardabweichung (SD) ermittelt und angezeigt werden (ergänzende Abbildung 5c ​​– e). Schließlich kann das Kryo-SIM-Bild mit dem Kryo-FIB-Bild zusammengeführt werden (ergänzende Abbildung 5f), um das Ziel für die anschließende Kryo-FIB-Herstellung hervorzuheben.

Mithilfe von AutoGrid ist die vorbereitete Kryo-Lamelle dann für das Kryo-ET-Experiment unter Verwendung eines 300-kV-Kryo-Elektronenmikroskops (z. B. FEI Titan Krios) bereit. Das Kryo-SIM-Bild ist auch nützlich, um den ROI für die Kryo-ET-Datenerfassung zu ermitteln.

Mithilfe des Protokolls der Open-Source-Software SIM-Check43 haben wir die Auflösung gemessen und die Stabilität/Qualität unseres Kryo-SIM-Systems überprüft (Ergänzende Abbildung 2d – i). Als Ergebnis wurde eine laterale Auflösung von ~200 nm und eine Z-Richtungsauflösung von ~500 nm erreicht (ergänzende Abb. 2e, f), die besser sind als das Weitfeldbild und das Entfaltungsbild (Abb. 2c). . Die verbesserte Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis verbesserten die Genauigkeit der ermittelten Z-Koordinaten der fluoreszierenden Mikrokügelchen, was für die anschließende Korrelationsgenauigkeit zwischen den 3D-Kryo-SIM- und 2D-Kryo-FIB-Bildern wichtig ist.

Anschließend haben wir die Zielgenauigkeit von Kryo-FIB anhand der 3D-Korrelationsinformationen in 3D-View gemessen. In unserer ersten Messung (Abb. 3a–e) verteilten wir zwei unterschiedlich große und farbige fluoreszierende Mikrokügelchen (Grün/0,5 μm, 505/515 nm, F8813, Thermo Fisher Scientific Corp., OR., Rot/0,2 μm, 580/ 605 nm, F8810, Thermo Fisher Scientific Corp., OR.) auf ein GraFuture RGO TEM Grid (GraFutureTM-RGO001A, Shuimu BioSciences Ltd., CN) aufgetragen und trocken gelassen. Dieses Raster wurde verwendet, um die Korrelationsgenauigkeit zwischen Kryo-SIM- und Kryo-FIB-Bildern zu messen. Wir haben sowohl den grünen als auch den roten Kanal von Kryo-SIM-Bildern aufgezeichnet (Abb. 3a), den Kanal der grün fluoreszierenden Mikrokügelchen ausgewählt, um die 3D-Kryo-SIM- und 2D-Kryo-FIB-Bilder zu korrelieren (Abb. 3b – d) und dann berechnet Standardabweichung der rot fluoreszierenden Mikrokügelchen (siehe Gleichung (8) in „Methoden“), was zu einer Korrelationsgenauigkeit von 110 nm führt (Abb. 3e und ergänzende Daten 2).

a HOPE-SIM-Bilder von getrockneten 0,5 μm großen grünen und 0,2 μm großen roten fluoreszierenden Mikrokügelchen, verteilt auf einem GraFuture RGO-Gitter. Die mit weißen Kreisen und Kreuzen markierten grünen Mikrokügelchen werden als Referenzregistermarkierungen verwendet. Die mit 1 bis 9 gekennzeichneten roten Mikrokügelchen werden zur Messung der Korrelationsgenauigkeit mit dem FIB-Bild verwendet. b Die Projektion des HOPE-SIM-Bildes nach 3D-Korrelation mit dem FIB-Bild. Mikrokügelchen, die den grünen Mikrokügelchen in (a) entsprechen, sind durch weiße Kreise und Kreuze markiert. c FIB-Bild. Mikrokügelchen, die den Mikrokügelchen in (a) und (b) entsprechen, sind durch weiße Kreise und entsprechende Kreuze gekennzeichnet. d 3D-Korrelation zwischen HOPE-SIM- und FIB-Bildern. Mit roten Kreisen markierte und mit 1 bis 9 beschriftete Mikrokügelchen entsprechen jeweils den roten Mikrokügelchen in (a). e Entsprechende Positionsabweichungen der neun roten Mikrokügelchen zwischen (a) und (d). f HOPE-SIM-Bild einer verglasten Lösung aus fluoreszierenden blauen Mikrokügelchen (grüner Kanal), gemischt mit Polymethylmethacrylat-Kügelchen, die direkt auf das EM-Gitter getropft wurden. Das Fluoreszenzbild (grüne Farbe) wird mit dem Hellfeldbild zusammengeführt. Fünf durch Polymethylmethacrylatkügelchen abgeschirmte Mikrokügelchen werden als Ziele ausgewählt und als B1-5 bezeichnet. g Kryo-FIB-Bild in der Zielregion. h Kryo-CLEM-Bild in der Region in (g). Die ausgewählten Mikrosphären in (f) sind entsprechend angegeben. i Kryo-FIB-Herstellung der Zielmikrosphären in (h). j Nach der Kryo-FIB-Herstellung wurde ein Kryo-REM-Bild (SE-Signal) des Gitters im Zielbereich aufgenommen und mit dem Fluoreszenzbild in (f) zusammengeführt. k Stark vergrößerte Kryo-REM-Bilder (SE-Signal) jeder Lamelle an den Positionen B1-B5. Die Querschnitte sowohl von 1 μm großen fluoreszierenden Mikrokügelchen als auch von größeren Polymethylmethacrylat-Kügelchen sind klar aufgelöst. Und die Durchmesser der Querschnitte fluoreszierender Mikrokügelchen können direkt aus den REM-Bildern gemessen werden und die resultierende statistische Verteilung der Durchmesser wird in (l) aufgetragen. Siehe Ergänzende Daten 5 für rohe Kryo-FIB-Bilder von (g), (h) und (j).

In unserer zweiten Messung (Abb. 3f – l) haben wir die gemischte Lösung aus 1 μm großen blauen Mikrokügelchen (430/465 nm, F13080, Thermo Fisher Scientific Corp., OR) vitrifiziert, um das reale experimentelle Verfahren des Ziel-Kryo-FIB-Fräsens nachzuahmen ) und 5 μm Polymethylmethacrylatkügelchen (PMMA5, Kai New Materials Ltd., CN) direkt auf dem EM-Gitter. Durch die Abschirmung großer Polymethylmethacrylatkügelchen wurden viele blaue Mikrokügelchen in das verglaste Eis eingebettet und ahmten das in der verglasten Zelle eingebettete fluoreszierende Ziel nach. Anschließend haben wir fünf eingebettete Mikrokügelchen (B1-5 in Abb. 3f) ausgewählt, um die Präzision des Ziel-Kryo-FIB-Fräsens zu testen. Zunächst verwendeten wir die nicht eingebetteten blauen Mikrokügelchen, die im Kryo-FIB-Bild erkennbar waren, um die 3D-Kryo-SIM- und 2D-Kryo-FIB-Bilder zu korrelieren (Abb. 3g, h). Das Korrelationsbild (Abb. 3h) zeigte, dass die ausgewählten Mikrokügelchen gemäß den korrelierten Fluoreszenzsignalen nicht erkennbar waren und sich genau in der Nähe der großen Polymethylmethacrylatkügelchen befanden. Anschließend wurde an diesen Zielpositionen ein Kryo-FIB-Fräsen durchgeführt (Abb. 3i, j). Die resultierende Kryolamelle mit einer Dicke von ~200 nm wurde dann mittels REM bei hoher Vergrößerung abgebildet (Abb. 3k). Die Durchmesser der gemahlenen Zielmikrokugeln wurden gemessen (Abb. 3l und ergänzende Abb. 6), was zu einer durchschnittlichen Durchmessermessung von 908 ± 106 nm führte (ergänzende Daten 3). Verglichen mit der statistischen Messung der Durchmesser der blauen Mikrokügelchen im kryogenen Zustand (Ergänzende Abbildung 7 und Ergänzende Daten 4), die zeigte, dass der durchschnittliche Durchmesser der blauen Mikrokügelchen 997 ± 32 nm betrug, war die Präzision des Ziel-Kryo-FIB-Fräsens in unserem Der Arbeitsablauf ist mindestens kleiner als 100 nm.

Insbesondere haben wir herausgefunden, dass die Verteilung der fluoreszierenden Mikrokügelchen in y-Richtung (senkrecht zur FIB-Scanrichtung) und die Präzision der Bestimmung der Z-Koordinaten der Mikrokügelchen Schlüsselfaktoren sind, die die Genauigkeit der Korrelation beeinflussen (siehe auch Ergänzende Anmerkung). 1).

Wir haben unseren HOPE-SIM-basierten Kryo-CLEM-Workflow angewendet, um reale biologische Systeme zu untersuchen. Der erste Test zielte auf die Mitochondrien von HeLa-Zellen ab, die mit MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen M7512, Thermo Fisher Scientific Corp., OR) gefärbt wurden. Mit der verbesserten Auflösung von Kryo-SIM können die Mitochondrien im Fluoreszenzbild gut aufgelöst und getrennt werden, und das ausgewählte Mitochondrium kann mit 3D-View für das Kryo-FIB-Fräsen präzise anvisiert werden, das anschließend mit Kryo-ET erfasst wurde (Abb . 1).

Zusätzlich zum Angriff auf Mitochondrien versuchten wir einen zweiten Test mit mehr biologischen Implikationen, um die Virusassemblierung in situ aus infizierten Zellen sichtbar zu machen. Herpesviridae ist eine große Familie, die aus Alpha-, Beta- und Gamma-Herpesviren besteht. Das murine Gammaherpesvirus 68 (MHV-68) kann wie humane Gammaherpesviren eine produktive Infektion von Fibroblasten oder Epithelzelllinien von Säugetierarten hervorrufen und ist daher ein Modellsystem für die Untersuchung pathogener Mechanismen, die mit einer Infektion mit humanen Gammaherpesviren verbunden sind. Die Reifung des Herpesvirus umfasst vier Stadien: Kapsidbildung in den Kernen, primäre Umhüllung und Durchgang durch die Kernmembran, Tegumentation und sekundäre Umhüllung im Zytoplasma sowie Austritt aus der Zelle44. Unter Verwendung herkömmlicher Transmissionselektronenmikroskopie von in Kunststoff eingebetteten Schnitten beobachteten frühere Studien „Tegumentablagerungen“ im Zytoplasma von MHV-68-infizierten BHK-21-Zellen, wo sich Kapside ansammeln, um eine Reihe von Tegumentproteinen zu bilden45.

Hier markierten wir das Kapsidprotein ORF65 von MHV-68 mit dem fluoreszierenden Tag mCherry (roter Kanal) und nutzten unseren HOPE-SIM-basierten Kryo-CLEM-Workflow, um die native In-situ-Struktur der „Tegumentablagerung“ in ORF65-mCherry zu untersuchen MHV-68-infizierte BHK-21-Zellen, die auf dem EM-Gitter kultiviert und vitrifiziert wurden (Abb. 4a – c). Wir verwendeten 1 μm große blaue Mikrokügelchen als Referenzmarker (grüner Kanal), um 3D-Kryo-SIM- und 2D-Kryo-FIB-Bilder in der 3D-Ansicht zu korrelieren, und identifizierten den Ort der Tegumentablagerung im Zytoplasma (Abb. 4d). Anschließend führten wir ein ortsspezifisches Kryo-FIB-Fräsen durch und präparierten Kryolamellen mit einer Dicke von 200 nm (Abb. 4e). Wir haben eine Kryo-REM-Aufnahme der Kryo-Lamelle mit geringer Vergrößerung aufgenommen, sie mit dem entsprechenden Kryo-SIM-Bild zusammengeführt und das Fluoreszenzsignal der in der Kryo-Lamelle befindlichen Zielviruspartikel bestätigt (Abb. 4f). Anschließend wurde die Kryo-Lamelle zur Kryo-EM-Bildgebung (Abb. 4g) und zur Kryo-ET-Rekonstruktion mit hoher Vergrößerung übertragen, wobei wir virale Zielpartikel fanden, die sich in der Tegumentation befanden (Abb. 4h und Zusatzfilme 3 und 4).

ein Hellfeldbild des Zielquadrats. b Die z-Projektion des HOPE-SIM-Fluoreszenzbildes. Grüne, fluoreszierende Mikrokügelchen. Rot, MHV-68-Virus. c Das Fluoreszenzbild in (b) wird mit dem Hellfeldbild in (a) zusammengeführt, um die Position des Zielsignals anzuzeigen. d 3D-Korrelation zwischen den Kryo-SIM- und Kryo-FIB-Bildern. e Kryo-FIB-Bild des Zielquadrats nach der Herstellung. f Kryo-SEM-Bild des Zielquadrats nach der Herstellung, das mit der z-Projektion des Kryo-SIM-Bildes in (b) zusammengeführt wird. g Kryo-EM-Aufnahme (×3.600) der Kryo-Lamelle in (f). Der durch das rote Rechteck markierte Zielbereich wird in (h) einer Kryo-ET-Rekonstruktion mit einer 64.000-fachen Vergrößerung unterzogen, wobei ein Schnitt des Tomogramms verschiedene Arten von Viruspartikeln zeigt, die sich in der Tegumentation befinden. Siehe Ergänzende Daten 6 für rohe Kryo-FIB-Bilder von (d) und (e), rohe Kryo-SEM-Bilder von (f) und rohe Kryo-EM-Bilder von (g).

Für den dritten Test haben wir ein anspruchsvolleres Ziel ausprobiert, nämlich das menschliche Zentriol in HeLa-Zellen. Menschliche Zentriolen stehen in engem Zusammenhang mit der Tumorentstehung und mehreren Erbkrankheiten46,47. In jeder Säugetierzelle gibt es nur ein oder zwei Paare von Zentriolen, was die In-situ-Untersuchung ihrer Strukturen ohne einen effizienten Kryo-CLEM-Arbeitsablauf stark einschränkt. Hier verwendeten wir HeLa-Zellen, die die mit mCherry markierte PACT-Domäne (Pericentrin-AKAP450 Centrosomal Targeting)48 exprimieren, die eine der Zentrosomenkomponenten ist, um das menschliche Zentriol durch Kryo-ET anzuvisieren und zu visualisieren (Abb. 5). Auch hier verwendeten wir 1 μm große blaue Mikrokügelchen als Referenzmarker (grüner Kanal), um die 3D-Kryo-SIM- und 2D-Kryo-FIB-Bilder in der 3D-Ansicht zu korrelieren und die Position der Zentrosomen zu identifizieren (Abb. 5a – d), was häufig der Fall ist erschienen als zwei Fluoreszenzpunkte in den Kryo-SIM-Bildern (Abb. 5c). Anschließend führten wir ein ortsspezifisches Kryo-FIB-Fräsen durch, um die Ziel-Kryolamellen mit einer Dicke von ~ 200 nm herzustellen (Abb. 5e, f), was anschließend durch Kryo-EM verifiziert wurde (Abb. 5g, h und ergänzende Abb. 8). Eine weitere Rekonstruktion durch Kryo-ET ergab die 3D-In-situ-Struktur eines Paares senkrechter Zentriolen (Abb. 5i – m und Zusatzfilme 5–8). Bemerkenswert ist, dass es uns nach unseren aktuellen Statistiken gelungen ist, 19 dicke Kryolamellen aus 19 vitrifizierten Zellen herzustellen und zur Kryo-SIM-Verifizierung zurückzusenden, und wir fanden heraus, dass 16 Kryolamellen das Fluoreszenzsignal der Zielzentrosomen beibehielten (Ergänzende Abbildung 9 und Ergänzende Abbildung 9). Daten 9), was auf eine hohe Targeting-Erfolgsquote schließen lässt.

Ein Hellfeldbild des Zielquadrats wird mit der z-Projektion des HOPE-SIM-Fluoreszenzbilds in (b) zusammengeführt, wobei die Mikrokügelchen (grün) gut verteilt sind und die fluoreszenzmarkierten Zentrosomen (rot) gut aufgelöst sind. Vier Sätze (C1-4) von Zentrosomen werden für die anschließende Kryo-FIB-Herstellung ausgewählt (C1-4). c Vergrößerte Ansicht der vier Zentrosomensätze in (b). d 3D-Korrelation zwischen HOPE-SIM- und Kryo-FIB-Bildern zur Lokalisierung der Positionen der ausgewählten Zentrosomen. e Kryo-FIB-Bild nach der Herstellung an den Positionen von C1-4 in (d). Die durch das blau gestrichelte Rechteck angezeigte Kryo-Lamelle C3 wird der Kryo-ET-Datenerfassung unterzogen. f Niedrig vergrößertes (×155) Kryo-EM-Bild der Kryo-Lamellen in (e). g Kryo-EM-Aufnahme der C3-Kryolamelle mit 4300-facher Vergrößerung. h Kryo-EM-Aufnahme (×8700) der C3-Kryolamelle im Bereich des roten Quadrats in (g). Die durch das weiße Quadrat markierte Zielregion wird der Kryo-ET-Datenerfassung und -Rekonstruktion unterzogen. i Eine Schicht des Tomogramms (×53.000) der Zielregion, die die Zielzentriolen zeigt, eines in der Draufsicht und eines in der Seitenansicht. j–m 3D-In-situ-Struktur des Zentriols in HeLa-Zellen mit verschiedenen Ansichten, (j) oben, (k) unten, (l) seitlich und (m) quer. Die Struktur wird mit EMAN261 segmentiert und in Chimera62 gerendert. Die Tripletttubuli sind in Gelb und die inneren Gerüststrukturen in Rosa dargestellt. Zu beachten ist, dass diese Struktur aus einem anderen Tomogramm (×26.000) einer Kryolamelle mit einer Dicke von ~300 nm abgeleitet wurde. Siehe Ergänzende Daten 7 für rohe Kryo-FIB-Bilder von (d) und (e) und rohe Kryo-EM-Bilder von (f).

Die In-situ-Strukturstudie von Makromolekülen in ihrem natürlichen zellulären Kontext mittels Kryo-ET ist zu einem neuen Gebiet der Strukturbiologie geworden. In der Folge ist die Nachfrage nach einer Verbesserung des gesamten Arbeitsablaufs, von der Probenvorbereitung über die Datenerfassung bis hin zur Bildanalyse, gestiegen. Darüber hinaus muss das aktuelle Protokoll der Bildkorrelation zwischen Kryo-FM, Kryo-FIB und Kryo-ET mit höherer Effizienz und Genauigkeit weiter verbessert werden. Das häufig verwendete Weitfeld-Kryo-FM13,21,22 oder die kürzlich entwickelte konfokale Kryo-Airyscan-Mikroskopie (CACM)12 haben eine begrenzte Auflösung und keine 3D-Auflösung, was die Korrelationsgenauigkeit mit dem nachfolgenden 2D-Bild von Kryo-FIB beeinträchtigt. Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie unter kryogenen Bedingungen basierend auf dem photonenaktivierten Lokalisierungsprinzip wurde mit einer Auflösung im Nanometerbereich entwickelt;40,49 allerdings erhöht die hohe erforderliche Beleuchtungsleistung das hohe Risiko einer Entglasung. Im Vergleich zur herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht SIM eine zweifache Verbesserung der beugungsbegrenzten Auflösung in drei Dimensionen28,34,35,36,37,38 bei relativ geringer Beleuchtungsleistung (10–100 mW cm−2). Der Weitfeldcharakter von SIM macht es lichteffizient und entkoppelt die Erfassungsgeschwindigkeit von der Größe des seitlichen Sichtfelds, was bedeutet, dass hohe Bildraten über große Volumina möglich sind37. Darüber hinaus kann SIM mit einem Superauflösungs-Bildgebungsalgorithmus38 oder einer progressiven Deep-Learning-Superauflösungsstrategie50,51 kombiniert werden, um eine höhere Auflösung zu erreichen. Daher bietet Kryo-SIM eine vielversprechende Lösung zur Verbesserung der Genauigkeit des aktuellen Kryo-CLEM-Workflows.

In dieser Studie haben wir einen HOPE-SIM-basierten Kryo-CLEM-Workflow entwickelt, indem wir das SIM-Modul in unser zuvor entwickeltes HOPE-System integriert haben, um hochauflösendes 3D-Kryo-FM zu ermöglichen, und das ursprüngliche Vakuumsystem aufgerüstet, um Eiskontamination/-ablagerung weiter zu verhindern. und das Schreiben der HOPE-SIM View/3D-View-Software zur Steuerung der Hardware und zur halbautomatischen Durchführung der Bildkorrelation. Wir haben gezeigt, dass unser HOPE-SIM-System Kryo-SIM-Bildgebung mit einer Auflösung von ~200 nm in lateraler Richtung und ~500 nm in z-Richtung erreichen kann. Diese Ergebnisse sind besser als die herkömmlichen Weitfeld-Kryo-FM- und Dekonvolution-Modi. Wir haben die Präzision der Korrelation zwischen Kryo-SIM und Kryo-FIB mit 110 nm verifiziert, was gut genug ist, um eine genaue ortsspezifische Kryo-FIB-Herstellung von Kryo-Lamellen mit einer Dicke von ~200 nm durchzuführen. Wir haben unseren HOPE-SIM-basierten Kryo-CLEM-Workflow angewendet, um MitoTracker-gefärbte Mitochondrien in HeLa-Zellen erfolgreich anzuvisieren, mCherry-markierte MHV-68-Virionen unter Tegumentation in infizierten BHK-21-Zellen sichtbar zu machen und ein Tomogramm der menschlichen Zentriolen in HeLa zu erstellen Zellen. Die hohe Erfolgsquote beim Targeting der menschlichen Zentriolen lässt auf die Robustheit und Genauigkeit unseres Kryo-CLEM-Workflows schließen.

Im Vergleich zum veröffentlichten und im Handel erhältlichen nicht integrierten Kryo-CLEM-System (Ergänzungstabelle 1) bietet unser HOPE-SIM-basiertes Kryo-CLEM-System zahlreiche Vorteile, einschließlich der Verwendung einer Hochvakuumkammer mit einer eingebetteten Objektivlinse mit hoher NA Wird bei Raumtemperatur aufbewahrt und verfügt über ein verbessertes Antikontaminationssystem, um eine hochauflösende Kryo-FM-Bildgebung über einen langen Zeitraum hinweg zu ermöglichen, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Linse einfriert/beschädigt wird und sich Eis bildet. Mit der speziell entwickelten Halterspitze zur Aufnahme des AutoGrid und des handelsüblichen Kryo-Multihalters kann die Kryoprobe effizient vom Kryo-FM zum Kryo-FIB und dann zum Kryo-ET übertragen werden, ohne das Gitter direkt zu berühren, was die Kosten minimiert Gefahr einer Probenbeschädigung während des Probentransfers. Mit der Kryo-SIM-Bildgebung und dem 3D-Korrelationsalgorithmus könnten wir eine hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie erreichen, insbesondere mit einer besseren Auflösung in Z-Richtung, und dann eine präzise 3D-Korrelation mit Kryo-FIB-2D-Bildern realisieren, was zu präzisen ortsspezifischen Kryoaufnahmen führt -FIB-Fräsen.

Zu beachten ist, dass neben den nicht integrierten Kryo-CLEM-Systemen kürzlich ein weiteres Kryo-CLEM-Konzept entwickelt wurde, das das Fluoreszenz-Bildgebungssystem in die Kryo-FIB/Kryo-SEM-Kammer integriert. Zu diesen integrierten Systemen gehören PIE-Scope22, iFLM52, METEOR53 und das koinzidente Dreistrahlmikroskop54 sowie die erst kürzlich von uns und unseren Kollegen veröffentlichten ELI-TriScope55 und CLIEM56. Neben der Vermeidung des Probentransfers während der Mikroskopie, um das Risiko von Probenschäden und Eiskontamination zu minimieren, können diese Systeme nach einer ordnungsgemäßen Vorkalibrierung auch eine korrelative Bildgebung ohne die Notwendigkeit fluoreszierender Referenzmarker erzielen54,55,56, wodurch der Kryo-CLEM-Arbeitsablauf erheblich verbessert wird Effizienz. Unser ELI-TriScope55 bietet einen weiteren einzigartigen Vorteil bei der Überwachung der Fluoreszenz des Ziels während des Kryo-FIB-Fräsens und minimiert so den Off-Target-Effekt, der durch das Kryo-FIB-Fräsen hervorgerufen wird und mit der Kryo-Lamellenverformung einhergeht. Das Design unseres HOPE-SIM-Systems ist vollständig kompatibel mit unserem ELI-TriScope-System, indem es denselben Kryo-Multihalter zum Transfer von Kryoproben verwendet und somit eine Komplettlösung für das zukünftige Kryo-CLEM-Experiment bietet.

Insgesamt bietet unser auf dem HOPE-SIM-System basierender Kryo-CLEM-Workflow eine effiziente, nicht integrierte Lösung, um eine genaue Ziel-Kryo-FIB-Herstellung von Kryo-Lamellen zu erreichen, die für eine ortsspezifische Kryo-ET-Studie bereit sind. Unser HOPE-SIM-System ist vielseitig und kann durch die Verwendung geeigneter Tische, Kryohalter und Kartuschen an verschiedene Fluoreszenz- und Elektronenmikroskope angepasst werden. In Zukunft werden wir neben der weiteren Integration mit unserem ELI-TriScope-System55 in eine Richtung auch unser HOPE-SIM-System mithilfe der progressiven Deep-Learning-Superresolution-Strategie aktualisieren, um eine höhere Auflösung zu erreichen, und die 3D-View-Software aktualisieren, um eine vollautomatische Umsetzung zu ermöglichen Bildkorrelation, wodurch eine effizientere und genauere, nicht integrierte Lösung des ortsspezifischen Kryo-FIB-Fräsens entsteht.

Für die HeLa- und BHK-21-Zellkultivierung wurden indizierte, ultraviolett-sterilisierte Gitter mit einem Viertelschnitt (D-Gitter, T11012SSF, TIANLD, China) verwendet.

HeLa-Zellen, die mit MitoTracker markiert waren oder mCherry exprimierten, fusioniert mit der PACT-Domäne (Pericentrin-AKAP450 zentrosomales Targeting)48, wurden auf ultraviolett-sterilisierte D-Gitter ausgesät und in vollständigem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin und Streptomycin. Nach 48 Stunden Kultur wurden die Gitter einem anschließenden Tauchgefrieren unterzogen.

BHK-21-Zellen wurden in vollständigem DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin und Streptomycin, kultiviert. Das Kulturmedium wurde routinemäßig alle zwei Tage gewechselt, indem die Hälfte des alten Mediums durch neues Medium ersetzt wurde. Die ultraviolett-sterilisierten D-Gitter wurden vor der Zellaussaat in eine Kulturschale mit 12 Vertiefungen gelegt (Kohlenstofffilmseite nach oben). Dann wurden BHK-21-Zellen ausgesät. Nachdem die Zellen an die D-Gitter gebunden waren, wurden sie 1 Stunde lang mit dem ORF65-mCherry-MHV-68-Virus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 100 infiziert. Dann wurde das Inokulum entfernt und durch frisches DMEM plus 10 % fötales Rinderserum ersetzt. Nach 24 Stunden Infektion wurden die D-Gitter einem Tauchgefrieren unterzogen.

Konkret wurden 1,5 μl blau fluoreszierende Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 1 μm (430/465 nm, F13080, Thermo Fisher Scientific Corp., OR) als Marker für die Korrelation zwischen den Kryo-SIM-3D- und Kryo-FIB-2D-Bildern verwendet Mit PBS im Verhältnis 1:400 verdünnt und mit der Seite, auf der die Zellen vor der Kryovitrifizierung wuchsen, auf das D-Gitter gegeben.

Ein schematisches Diagramm des optischen Pfads des HOPE-SIM-Systems ist in Abb. 2a dargestellt, und ein Bild des realen optischen Aufbaus ist in der ergänzenden Abb. 2a dargestellt. Wir haben einen Laserkombinator aus drei Lasern mit Wellenlängen von 405 nm (50 mW, OBIS 405LX, Coherent), 488 nm (200 mW, SAPPHIRE 488-200 CW, Coherent) und 561 nm (200 mW, SAPPHIRE 561-200) aufgebaut CW, kohärent). Der vom Laserkombinator emittierte Laserstrahl durchläuft einen akusto-optischen abstimmbaren Filter (Amplitudenmodulator, AOTF, AOTFnC-400.650-TN & MPDS4C-B66-22-74.158-RS-Controller, Quanta Tech) und dehnt sich dann auf einen Durchmesser von 25 aus mm. Anschließend durchläuft der Strahl einen Phasen- und Winkelmodulator, der aus einem polarisierenden Strahlteilerwürfel (PBS, CCM1-PBS251, Thorlabs), einer achromatischen Halbwellenplatte (HWP, AHWP10 M-600, Thorlabs) und einem Ferroelektrikum besteht räumlicher Lichtmodulator (SLM, QXGA-3DM, Forth Dimension Displays) zur Erzeugung einer gemusterten Beleuchtung mit drei alternativen Ausrichtungen (ergänzende Abbildung 2b). Diese drei gemusterten Strahlen passieren eine weitere Linse und werden in der Beugungsebene mithilfe einer maßgeschneiderten Maske moduliert, die aus einer lichtdichten Scheibe mit einer Sieben-Loch-Blende besteht. Für jeden strukturierten Strahl werden nur Beugungen der Ordnungen 0 und ±1 ausgewählt. Alle drei strukturierten Strahlen werden schließlich auf die hintere Brennebene der Objektivlinse fokussiert (ergänzende Abbildung 2c). Nach dem Durchgang durch die Objektivlinse werden Interferenzmuster (Moiré-Streifen) mit fünf Phasen (0, π/5, 2π/5, 3π/5, 4π/5) und drei Rotationswinkeln (0°, 60° und 120°) erzeugt °). Die Periode, Ausrichtung und relative Phase dieses Anregungsmusters können durch Anpassen des SLM-Setups fein abgestimmt werden. Für jede Ausrichtung und Phase des Anregungsmusters werden die resultierenden Fluoreszenzsignale von der Objektivlinse gesammelt und auf einer hochempfindlichen sCMOS-Kamera (Prime 95B, Photometrics) aufgezeichnet. Alle im System verwendeten Linsen sind als achromatische Dubletts gewählt. Zur Verbesserung der Beleuchtungsqualität werden optische Blenden und Masken eingesetzt.

Rohdatenserien von 3D-SIM unter Verwendung einer Trockenobjektivlinse (NA 0,9) wurden mit einem Inkrement von 250 nm entlang der Z-Achse gesammelt. Für jeden Z-Schnitt wurden 15 Bilder für fünf Phasen und drei Ausrichtungen aufgenommen, um die Nyquist-Shannon-Stichprobe zu erfüllen. Jedes Rohbild hat eine Pixelgröße von 120 nm und ein Sichtfeld (FOV) von 1200 × 1200 Pixel. Dann hat der endgültige Rohbildstapel eine Voxelgröße von 120 × 120 × 250 nm. Die Belichtungszeit für jedes Rohbild hängt von der Gesamtintensität des Fluorophors ab. Normalerweise wurde der gesamte Datensatz innerhalb einer durchschnittlichen Zeit von 5–10 Minuten erfasst, um ein Sichtfeld mit der erforderlichen Z-Tiefe von ~20 μm zu erfassen.

SIM-Bildrekonstruktionen wurden mit SoftWoRx 6.1.1 (GE Healthcare) mit den folgenden Einstellungen durchgeführt: kanalspezifische optische Übertragungsfunktionen (OTFs), eine Wiener-Filterkonstante von 0,010, ein Hintergrund mit verworfenen negativen Intensitäten und Driftkorrektur in Bezug auf erster Winkel. OTFs wurden aus Punktspreizfunktionen (PSFs) von SoftWoRx 6.1.1 generiert und PSFs des HOPE-SIM-Systems bei kryogenen Temperaturen wurden unter Verwendung von 200-nm-fluoreszierenden Mikrokügelchen (405 nm/488 nm/560 nm, Thermo Fisher Scientific Corp.) gemessen ., ODER). Für jedes Z-Slice enthält das endgültige rekonstruierte Bild 2400 × 2400 Pixel mit einer Pixelgröße von 60 nm. Die Open-Source-Software SIMcheck43 wurde verwendet, um die Leistung des optischen SIM-Systems zu überprüfen, Parameter abzustimmen und Artefakte zu erkennen.

Wir haben den Koordinatenvektor jeder fluoreszierenden Mikrokugel als X = \(\left[\begin{array}{c}x\\ y\\ z\end{array}\right]\) definiert. Dies lieferte zwei Datensätze von Vektoren, \({X}_{{SIMi}}(i=1,\ldots ,N)\) und \({X}_{{FIBi}}(i=1,\ldots , N)\) für die ausgewählten entsprechenden fluoreszierenden Mikrokügelchen aus den Kryo-SIM- bzw. Kryo-FIB-Bildern. Der Schwerpunkt jedes Datensatzes kann wie folgt berechnet werden:

In dieser Studie haben wir die Rotationsoperation R(\(\theta\)) von drei Euler-Winkeln (\({\theta }_{x}\), \({\theta }_{y}\), \ ({\theta }_{z}\)) wie folgt:

Die 3D-Koordinaten der fluoreszierenden Mikrokügelchen im Kryo-SIM-Volumen können wie folgt in 2D-Koordinaten auf der Koordinatenebene des Kryo-FIB-Bildes übersetzt werden:

wobei P(z) die Projektion entlang der z-Richtung ist und das Z-Y-X-Rotationstransformationssystem verwendet wird.

Darüber hinaus werden die Koordinaten der fluoreszierenden Mikrokügelchen im Kryo-FIB-Bild wie folgt übersetzt:

Nach Gl. (6) und (7) kann die Abweichung der Korrelation zwischen den Kryo-SIM- und Kryo-FIB-Datensätzen wie folgt definiert werden:

Mithilfe der Methode der kleinsten Quadrate kann der optimierte Euler-Winkel \(({{\theta }_{x},\theta }_{y}\,{,\theta }_{z})\) gelöst werden, um ihn zu minimieren Korrelationsabweichung XSD. Schließlich können die Kryo-SIM-3D-Volumendaten mithilfe von Gleichung projiziert und mit dem 2D-Kryo-FIB-Bild zusammengeführt werden. (6). Die im Kryo-SIM-Bild definierten Zielpositionen können auf dem Kryo-FIB-Bild präzise lokalisiert werden.

Die deutlich sichtbaren fluoreszierenden Mikrokügelchen um die Zielzelle herum wurden manuell aus den Kryo-SIM-3D- und Kryo-FIB-Bildern ausgewählt. Die Verteilung der ausgewählten fluoreszierenden Mikrokügelchen sollte für eine bessere Korrelationsgenauigkeit auf beiden Seiten der Zelle erfolgen, insbesondere in y-Richtung. Zunächst wurden die Mittelpunkte der Mikrokügelchen in der XY-Ebene bestimmt. Um die Korrelation zwischen zwei korrelativen Bildern weiter zu optimieren, könnte die Z-Höhe der fluoreszierenden Mikrokügelchen manuell entsprechend der Form der fluoreszierenden Mikrokügelchen angepasst werden (gezeigt im Zusatzfilm 2). Auf dem Kryo-FIB-Bild war das Zentrum der Mikrosphäre schwer zu erkennen, da die Mikrosphäre normalerweise im Eis eingebettet war und als Erhebung erschien. Die Position der Oberseite der Erhebung repräsentiert die Position der Kante der Mikrokügelchen. Mit diesem Wissen konnte daher das Zentrum der Mikrosphäre im Kryo-FIB-Bild bestimmt werden, indem die Position ermittelt wurde, die sich auf der Hälfte des Durchmessers der Mikrosphäre von der Oberseite des Höckers entlang der y-Richtung (FIB-Fräsrichtung) befand. Nach der ersten Korrelationsrunde wurden einige Mikrokügelchen mit großen Abweichungen aufgrund erheblicher Fehler bei der Bestimmung ihrer Zentren entfernt. Die Korrelationsparameter wurden dann durch Optimierung der Z-Achsenposition jeder Mikrosphäre aktualisiert. Alle diese Bildkorrelationsoperationen wurden in der 3D-Ansicht durchgeführt (ergänzende Abbildung 5).

Kryolamellen wurden durch Kryo-FIB-Fräsen unter Verwendung des FEI Helios NanoLab 600i- oder Aquilos-2 FIB-SEM-Mikroskops (Thermo Fisher Scientific Corp., OR) hergestellt. Zielzellen mit klaren Fluoreszenzsignalen wurden gemäß der obigen Korrelationskarte ausgewählt. Anschließend wurde das Gitter 5 s lang bei einem Arbeitsabstand von 5 mm mit einer metallorganischen Platinschicht beschichtet. Kryolamellen mit einer Dicke von ca. 200 nm wurden durch schrittweises Mahlen unter Verwendung eines 4-stufigen Ga+-Strahlstroms von 0,43 nA, 0,23 nA, 80 pA und 40 pA bei einem Tischwinkel von 13–22° erhalten.

Die Kryolamellen wurden in einen FEI Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific Corp., OR.) geladen, der mit einer Gatan GIF K2 4k × 4k-Kamera (Gatan, Inc., Warrendale, PA) ausgestattet war und bei 300 kV betrieben wurde Niedrigdosismodus. Neigungsreihen wurden bidirektional mit der SerialEM-Software57 unter Verwendung eines Neigungsbereichs von –60° bis 40° in 2°-Intervallen, einer nominalen Vergrößerung von ×33.000 oder ×53.000, einer Defokussierung von –4 ~–6 μm und einer Gesamtdosis von ~150 e Å− erfasst 2. Die Neigungsreihen wurden mit einem gewichteten Rückprojektionsalgorithmus unter Verwendung von IMOD58 ausgerichtet und rekonstruiert oder unter Verwendung von ICON59,60 rekonstruiert.

Die Bildsegmentierung des Zentriol-Tomogramms wurde mit EMAN261 durchgeführt und das 3D-Rendering wurde mit Chimera62 durchgeführt.

Alle Messungen wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt, was zu ähnlichen Ergebnissen führte. Die Statistikprofile und Zahlen wurden mit LabVIEW, Origin oder Excel erstellt. Die Stichprobengröße jeder Messung wurde in der Arbeit angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen mikroskopischen Aufnahmen und rohen Statistikdaten in dieser Studie werden als ergänzende Daten bereitgestellt. Die rohen Neigungsserien und rekonstruierten Tomogramme sind auf Anfrage erhältlich.

Das LabVIEW-Programm HOPE-SIM View zur Steuerung des Geräts ist hardwareabhängig und das 3D-View-Programm zur Bildkorrelation ist hardwareunabhängig. Diese beiden Programme sind auf GitHub unter dem Link https://github.com/hilbertsun/HOPE-SIM verfügbar.

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Alle Kryo-CLEM-, FIB- und ET-Arbeiten wurden im Center for Biological Imaging (CBI, http://www.ibp.cas.cn/cbi/), dem Institute of Biophysics (IBP) und der Chinese Academy of durchgeführt Naturwissenschaften (CAS). Wir danken Dr. Xiaojun Huang, Boling Zhu, Xujing Li und Lihong Chen für ihre Hilfe bei der Kryo-EM-Datenerfassung und Herrn Zeyang Li und Frau Lulu Qin für ihre Hilfe bei der Kryo-FIB-Herstellung. Wir möchten uns auch bei Dr. Fulin Wang und Prof. Jianguo Chen von der Universität Peking für ihre Freundlichkeit bei der Bereitstellung von HeLa-Zellen, die mCherry-PACT exprimieren, sowie bei Prof. Wei Ji und Prof. Dong Li vom IBP für ihre freundliche Hilfe bei der Lichtmikroskopie bedanken Frau Ziyan Wang und Dr. Yun Zhu vom IBP für ihre freundliche Hilfe bei der Kryo-ET-Datenverarbeitung. Diese Arbeit wurde gleichermaßen durch Zuschüsse des chinesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (2017YFA0504700 an GJ), des Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB37040102 an FS) und der National Natural Science Foundation of China (31830020 an FS) unterstützt. . Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Technological Innovation Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (29Y8CZ021001 an GJ), dem CAS Key Technical Support Personnel Project (29Y9CQ041 an GJ) und der National Natural Science Foundation of China (31801199 an SL, 31801201 bis XJ und 81630059 bis HD).

Zentrum für biologische Bildgebung, Kerneinrichtungen für Proteinwissenschaft, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100101, Peking, China

Shuoguo Li, Xing Jia, Tongxin Niu, Xiaoyun Zhang, Chen Qi, Wei Xu, Fei Sun und Gang Ji

Nationales Schlüssellabor für Biomakromoleküle, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100101, Peking, China

Shuoguo Li & Fei Sun

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, 100049, Peking, China

Shuoguo Li, Hongyu Deng, Fei Sun und Gang Ji

CAS Key Laboratory of Infection and Immunity, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100101, Peking, China

Hongyu Deng

CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 100101, Peking, China

Hongyu Deng & Fei Sun

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GJ und FS initiierten und überwachten das Projekt. GJ und SL entwarfen und konstruierten das HOPE-SIM-System unter der Anleitung von WXGJ, der die Softwareprogramme schrieb. SL führte die Kryo-CLEM-Experimente und Kryo-ET-Arbeiten durch. XJ, XZ und HD führten die Zellkultivierungs- und Vitrifizierungsexperimente durch. XJ, GJ und SL führten die Kryo-FIB-Herstellungsarbeiten durch. TN, SL, XJ und CQ führten eine Bildverarbeitung durch. SL, GJ und FS analysierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Fei Sun oder Gang Ji.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Teilen dieser Studie (HOPE-SIM-System) wurde ein chinesisches Patent für Erfindungen (CN202110919044.4) zugewiesen.

Communications Biology dankt Gong-Her Wu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Li, S., Jia, X., Niu, T. et al. HOPE-SIM, ein kryostrukturiertes Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopiesystem für die zielgerichtete Kryo-Elektronentomographie. Commun Biol 6, 474 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04850-x

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Eingegangen: 19. September 2022

Angenommen: 18. April 2023

Veröffentlicht: 29. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04850-x

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