Modulare automatisierte mikrofluidische Zellkulturplattform reduziert glykolytischen Stress in Organoiden der Großhirnrinde

Feb 04, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 20173 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Organ-on-a-Chip-Systeme kombinieren Mikrofluidik, Zellbiologie und Tissue Engineering, um organspezifische 3D-In-vitro-Modelle zu kultivieren, die die Biologie und Physiologie ihrer In-vivo-Gegenstücke nachbilden. Hier haben wir eine Multiplex-Plattform entwickelt, die die Kultur einzelner Organoide in isolierten Mikroumgebungen mit benutzerdefinierten Medienflussraten automatisiert. Programmierbare Arbeitsabläufe ermöglichen die Verwendung mehrerer Reagenzreservoirs, die zur direkten Differenzierung, zur Untersuchung zeitlicher Variablen und zum langfristigen Züchten von Kulturen eingesetzt werden können. Hier werden neuartige Techniken zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Chips beschrieben, die Merkmale auf der oberen und unteren Ebene eines einzelnen PDMS-Substrats ermöglichen. Die RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) automatisierter Organoidkulturen der Großhirnrinde zeigt Vorteile bei der Reduzierung des glykolytischen und endoplasmatischen Retikulumstresses im Vergleich zu herkömmlichen In-vitro-Zellkulturen.

Die Zellkultur ist seit über 70 Jahren seit der Isolierung von HeLa-Zellen aus einer menschlichen Gebärmutterhalskrebsbiopsie ein Hauptmodell für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und deren Entwicklung1,2. Ursprünglich als Vehikel zur Erforschung von Viren eingesetzt, wurden die Protokolle für die Kultur menschlicher Zellen für ein schnelles und einfaches Wachstum zur Produktion großer Materialmengen optimiert. Während die Gewebekulturprotokolle Fortschritte gemacht haben, insbesondere bei der Reduzierung vieler Medienkomponenten, bleiben viele dieser Originalrezepte bestehen. Es gibt noch viel Raum für Verbesserungen bei Gewebekulturprotokollen, um physiologische Nährstoffkonzentrationen, -zufuhr und -entfernung nachzuahmen. Die automatisierte Mikrofluidik ermöglicht es uns, über herkömmliche Protokolle hinauszugehen, indem wir mit Raten und Präzision zuführen, die manuell nicht möglich wären.

Jüngste Fortschritte in der Stammzell- und Entwicklungsbiologie haben zu genaueren Modellen geführt, die Aspekten des primären menschlichen Gewebes ähneln3,4. Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die zusammen als pluripotente Stammzellen (PSCs) bezeichnet werden, haben das Potenzial, sich in die meisten Zelltypen des Körpers zu differenzieren, und Protokolle nutzten dies, um 3D-Kulturmodelle zu erstellen für menschliches Gewebe, einschließlich Gehirn, Darm, Leber und Brust5,6. Diese selbstassemblierenden, organspezifischen Zellkulturen, sogenannte Organoide, werden häufig als In-vitro-Modelle in der Entwicklungsforschung, Pathogenese und Medizin eingesetzt7,8,9. Organoide ahmen wichtige funktionelle Merkmale der Physiologie ihres primären Gewebegegenstücks genauer nach als 2D-Zellkulturen6. Über die Verwendung als In-vitro-Modelle hinaus werden Organoide auch für Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Gesundheitswesen als Gewebe für Implantate untersucht5. Da die Technologie neue Grenzen eröffnet, besteht ein steigender Bedarf an besseren Methoden zum Züchten, Kontrollieren und Analysieren organoider Kulturen. Es besteht die Notwendigkeit, die Kluft zwischen In-vitro-Kulturen und Primärgewebe zu verringern. Bemühungen wie die hier gezeigten Fortschritte nutzen Präzisionsmikrofluidik, Roboterautomatisierung und berührungslose Sensorik, um eine robuste, reproduzierbare Zellkultur zu ermöglichen, die für die Gewebetreue optimiert ist.

Die Fähigkeit PSC-abgeleiteter Organoide, sich selbst zu organisieren und viele gewebespezifische Zelltypen zu erzeugen, macht sie besonders nützlich für die Modellierung komplexer Gewebe und Systeme. Das Gehirn weist einige der höchsten Komplexitäten im menschlichen Körper auf, und Forscher können mit Organoid-Technologie hochwertige Modelle verschiedener Gehirnregionen erstellen. Zerebrale Organoide sind eine Form von Gehirnorganoiden, die die Physiologie der Großhirnrinde modellieren und viele kortexspezifische Zelltypen und Unterregionen enthalten10. Diese Organoide werden häufig für die Forschung zur pränatalen Gehirnentwicklung11,12,13, zu Gehirnpathologien14 und für therapeutische Tests15 verwendet. Zerebrale Organoide erreichen bei längerer Kultivierung einen Durchmesser von einigen Millimetern und können unbegrenzt in der Kultur gehalten werden16.

Abbildung 1 veranschaulicht den Prozess der Erzeugung menschlicher Gehirnorganoide durch Aggregation menschlicher PSCs17,18. Die neuronale Induktion wird durch die Hemmung der WNT- (IWR1-\(\varepsilon\)) und Nodal/Activin-Signalwege (SB431542) erreicht und führt zu sowohl dorsalem als auch ventralem kortikalem Gewebe. Da die Entwicklung von Organoiden ähnlich schnell verläuft wie die primäre Entwicklung des Fötus, müssen diese Kulturen über Wochen bis Monate aufrechterhalten werden, um Zelltypen und Gewebestrukturen im Spätstadium zu beobachten. Dazu gehören terminal differenzierte Zelltypen wie Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten sowie die Beobachtung lokal organisierter Rosetten, die aus neuralen Stammzellen der radialen Glia bestehen (Abb. 1B). Aktuelle Protokolle für zerebrale Organoide weisen Einschränkungen in Bezug auf Durchsatz, Konsistenz und Zuverlässigkeit sowie gesundheitliche Beeinträchtigungen auf und zeigen typische Anzeichen von zellulärem Stress19,20. Der Phänotyp von Zellstress ist wahrscheinlich multifaktoriell; Allerdings können viele Faktoren aus der traditionellen Zellkultur resultieren. Das Tempo des manuellen Medienwechsels (häufig alle 1–3 Tage) führt zu unregelmäßigen Schwankungen der Nährstoffverfügbarkeit und der Bildung toxischer Metaboliten. Durch die Fütterung außerhalb des Inkubators erfahren die Zellen kältere Temperaturen und weniger gelöstes Kohlendioxid, was zu einer alkalischeren Umgebung führt. Die Laborautomatisierung setzt sich in den Biowissenschaften immer stärker durch, um die Auswirkungen dieser unkontrollierten Variablen zu reduzieren und die Quantität und Qualität der Experimente zu erhöhen, was eine einfache Langzeitwartung mit minimalem manuellen Aufwand ermöglicht.

Überblick über das Protokoll zur Erzeugung menschlicher zerebraler Organoide. (A) Humane pluripotente Stammzellen werden in einer traditionellen 2D-Kultur expandiert, dissoziiert, in Mikrovertiefungen aggregiert und unter Verwendung definierter Medienbedingungen zu 3D-Organoidkulturen gereift, um die Differenzierung des Hirnrindengewebes zu fördern. In dieser Studie wurden die Organoide am 12. Tag nach der Aggregation entweder in Suspension gehalten und manuell gepflegt (schwarzer Pfeil) oder in einzelne Vertiefungen eines Mikrofluidikchips überführt und automatisiert gehalten (blauer Pfeil). (B) Bilder von zerebralen Organoidkulturen. Hellfeldbilder bei niedriger (links) und hoher (Mitte) Vergrößerung unter Standardkulturbedingungen zeigen organoide Morphologie und Heterogenität. Immunfluoreszenzfärbungen in Woche 5 für PAX6 (grüne, radiale Glia-Vorläuferzellen), CTIP2 (BCL11B) (Magenta, exzitatorische Projektionsneuronen), ZO-1 (TJP1) (weiße, Tight-Junction-Proteine ​​an den Endfüßen der radialen Glia, apikale Oberfläche des Neurals). Röhre) zeigen charakteristische ventrikuläre zonenartige Rosettenstrukturen mit radialen Gliazellen, die von Neuronen umgeben sind. Mit DAPI (blau) gefärbte Kerne. (C) Bild des PDMS-Mikrofluidikchips. Der maßgeschneiderte Zellkulturchip, der einer Standardplatte mit 24 Vertiefungen nachempfunden ist, beherbergt Organoide für automatisierte Experimente.

In der konventionellen Zellkultur sind die Abgabe, Bewegung und Entfernung von Flüssigkeit die notwendigen Aktionen, die in allen Protokollen erforderlich sind. Daher sind die Handhabung von Flüssigkeiten und die ordnungsgemäße Lagerung flüssiger Reagenzien Schlüsselfaktoren für die Automatisierung dieses Prozesses. Aktuelle Liquid-Handling-Technologien werden grob in zwei Kategorien eingeteilt: kontinuierliche Durchflusstechnik und digitale Mikrofluidik21. Kontinuierliche Durchflusssysteme basieren auf einem stationären Flüssigkeitsfluss, der durch Druck-, mechanische oder elektrokinetische Pumpen erzeugt wird. Bei konstantem Durchfluss bieten diese Systeme eine hohe Geschwindigkeits- und Homogenitätskontrolle; Allerdings sind sie für komplexe Fluidmanipulationen weniger flexibel und schwierig zu skalieren. Geschlossene Kanalsysteme, die sich aus einem kontinuierlichen Fluss ergeben, sind von Natur aus schwer zugänglich, erfordern die Verwaltung eingeschlossener Gase und lassen sich nicht gut skalieren, da die Parameter, die den Fluss an einem einzelnen Ort steuern, von den Eigenschaften des gesamten Systems abhängen.

Im Gegensatz dazu steuern tröpfchenbasierte oder segmentierte Flussmikrofluidik diskrete Volumina, was für die Tröpfchenmanipulation22, das Mischen, die Einkapselung, das Sortieren, die Erfassung und Experimente mit hohem Durchsatz23 praktisch ist. In Kombination mit Ventilen kann die tröpfchenbasierte Mikrofluidik die meisten logischen Operationen an Tröpfchen zum Sortieren, Zusammenführen und Teilen durchführen. Polydimethylsiloxan (PDMS) ist aufgrund seiner geringen Kosten, seiner Vielseitigkeit beim Prototyping und seiner hohen Gasdurchlässigkeit das am häufigsten verwendete Material zur Herstellung mikrofluidischer Geräte24. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik hat viele Steuerungsmöglichkeiten geschaffen, die in der manuellen Praxis entweder unmöglich oder unpraktisch sind, wie beispielsweise die Planung der Fütterungshäufigkeit. Innerhalb beider Technologien gibt es verschiedene kontaktbehaftete und berührungslose25 Ansätze. Kontaktflüssigkeitshandhaber erfordern eine Spitze, die Flüssigkeit enthält, um auf das Substrat zu treffen, ähnlich wie beim Pipettieren, jedoch mit größerer Präzision und Kontrolle. Berührungslose Flüssigkeitshandhabungsgeräte manipulieren Flüssigkeitsdrücke und -geschwindigkeiten, um den Fluss zu steuern. Beide Technologien haben sich auf extrem niedrige Volumina (Nanoliter) und extrem niedrige Durchflussraten (Mikroliter pro Stunde) ausgeweitet.

Organoide werden üblicherweise in Chargen gezüchtet, wobei mehrere Organoide in einzelnen Vertiefungen einer Platte suspendiert werden. Die gemeinsamen Bedingungen in einem einzigen Well unterstützen die Chargenkonsistenz; Wenn jedoch die Anzahl der Variablen in einem Experiment erhöht wird, beispielsweise bei einem Experiment mit mehreren Genotypen, wird der Durchsatz zu einer Herausforderung. Darüber hinaus eignen sich Multiwellplatten nicht gut zur Steuerung dynamischer Bedingungen oder zur Erzeugung von Konzentrationsgradienten in den Medien. Im Gegensatz dazu ermöglichen mikrofluidische Chips als organoide Kulturkammern eine präzise Kontrolle der Umgebungsbedingungen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung26,27. Mit seriellen Verdünnungen können automatisierte Gradienten erreicht werden, und der volumetrische Roboterfluss kann Experimente mit hohem Durchsatz effizient verwalten. Bei der Wahl des Geräts für die Laborautomatisierung sollten Einsatz, Flexibilität und Kosten berücksichtigt werden. Unter Berücksichtigung der Mikroumgebung der Zellkultur bietet ein berührungsloses System ähnlich dem hier entwickelten wichtige Vorteile bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Nährstoffkonzentrationen, der Reduzierung der Bildung von Stoffwechselnebenprodukten und der Erzeugung von Scherkräften, die den In-vivo-Bedingungen ähnlicher sind.

Hier haben wir eine PDMS-basierte, berührungslose Mikrofluidikplattform mit segmentierter Zufuhr entwickelt, um eine längere Zellkultur zu automatisieren. Die Plattform ist für viele Organoidprotokolle und Gradientenassays konfigurierbar. Die Plattformschnittstelle ermöglicht die Integration mit anderen Forschungsinstrumenten wie einem Inkubator-Bildgebungssystem über das Internet der Dinge. Wir haben diese Plattform evaluiert, indem wir ihre Fähigkeit getestet haben, das Wachstum und die Entwicklung von Organoiden der menschlichen Großhirnrinde zu unterstützen.

Wir haben eine automatisierte, mikrofluidische Zellkulturplattform zur Optimierung des 3D-Organoidwachstums entwickelt, die „Autoculture“-Plattform. Das System besteht aus sechs miteinander verbundenen Modulen (Abb. 2): (1) Kühlschrank mit Reagenzbehältern (z. B. frische Medien), (2) Spritzenpumpe, Verteilerventile und Steuerschnittstelle, (3) konditionierte Mediensammelbehälter im Kühllager , (4) ein mikrofluidischer serieller Bus, der mit einem Zellkulturinkubator verbunden ist, und (5) ein multiplexierter mikrofluidischer Organoidchip, der (6) Organoide in ihrem Mikroumgebungsgefäß (1 von 24 Vertiefungen) immobilisiert. Um die Organoide zu versorgen, wird jeder einzelne Brunnen von einer Fluidsteuerung bedient; Der Controller entfernt verbrauchte Medien durch Absaugen zu einem Kollektor im Kühllager und füllt den Behälter dann in programmierbaren Intervallen mit frischen Medien auf.

Jeder der 24 Brunnen dieses Systems ist ein separates, isoliertes Experiment mit einem eigenen Einlassrohr, Auslassrohr und Sammelbehälter. Der Fütterungsplan jedes Wells ist in Bezug auf Rate und Medium vollständig anpassbar, um die Flexibilität des Experimentierens zu erhöhen. Ein Bereich von 5–1000 \(\upmu \hbox {L}\) Aliquots aus 3 Medien-/Reagenzienreservoirs kann für jede Vertiefung geplant werden. Medien-/Reagenzbehälter können auch in Kombination verwendet werden. Jede Vertiefung bildet konstruktionsbedingt einen Flüssigkeitskreislauf, der die Isolierung von den anderen Kreisläufen auf der Platte aufrechterhält (siehe „Methoden“). Eine volle 24-Well-Platte wird in 72 Sekunden gewartet, und die Zeit zwischen den Flüssigkeitsinjektionen kann beliebig lang sein (z. B. jede Stunde, zweimal täglich, jeden zweiten Tag usw.). Konditionierte Medien können zu jedem Zeitpunkt während oder nach dem Experiment für die molekulare Analyse entnommen werden, ohne dass die Kultur gestört wird. Zur Sammlung entnommene konditionierte Medien werden durch eine Luftphase in den Ausflusskanälen von den Kulturen getrennt, um das Infektionsrisiko zu verringern, das durch inaktives Medium in den Leitungen entstehen kann. Nach dem Experiment werden die Organoide zur molekularen Analyse entnommen.

Design und Implementierung der automatisierten, mikrofluidischen Kulturplattform. (A) Illustration der automatisierten, mikrofluidischen Organoid-Kulturplattform, der Autokultur. (B) Vorderansichtbilder der Autokultur. (1) Kühlschrank mit Reagenzreservoirs. (2) Spritzenpumpe, Verteilerventile und Steuerschnittstelle. (3) Kühlschrank mit klimatisierten Mediensammelbehältern. Diese Komponenten befinden sich auf einem Labortisch direkt über dem Zellkultur-Inkubator. (4) Mikrofluidikröhrchen werden durch einen Inkubatoranschluss eingeführt und mit dem (5) Mikrofluidik-Wellplattenchip im Inkubator verbunden. (6) Querschnittsdiagramm einer einzelnen Vertiefung mit einer Organoidkultur.

Mit diesen Kontrollparametern können ganze Platten den gleichen Arbeitsablauf ausführen, um konsistente Chargen von Organoiden zu erzeugen. Man kann ein Reagenz auch mit einem inkrementellen Konzentrationsgradienten von Vertiefung 1 bis 24 titrieren. Darüber hinaus kann man mehrere Protokolle/Fütterungspläne auf der Platte ausführen und die Medienkomponenten oder Fütterungspläne zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Experiments ändern.

Das Internet der Dinge (IoT) von Amazon Web Services (AWS) bietet ein praktisches Steuerungsframework für mehrere Geräte, um Informationen zu kommunizieren und Aktionen einzuleiten. Mit einem Kommunikationsprotokoll wie Message Queuing Telemetry Transport (MQTT) können Systeme synchronisierte, koordinierte Kontroll- und Datenerfassungsbemühungen in Echtzeit über das Internet verwalten28. Die System-zu-System-Kommunikation erfolgt über ein lokales Netzwerk (LAN), während Forscher Daten oder Aktionen bei Bedarf aus der Ferne abrufen können. Daher hat die Autoculture-Softwarearchitektur die Kontrolle über die AWS Cloud, um Experimente nach Bedarf zu entwerfen, zu starten, anzuhalten, zu bearbeiten und zu stoppen (Abb. 3).

IoT-Cloud-Integration: Eine im Internet gehostete grafische Benutzeroberfläche leitet Nachrichten über MQTT an die Autoculture-Plattform weiter, um Experimente zu starten, zu überwachen und zu beenden.

Das Rechenmodul des Raspberry Pi wurde verwendet, um Experimente lokal durchzuführen und über MQTT weitergeleitete Befehle zu akzeptieren. Die Anwendungsprogrammschnittstelle (API), die zum Senden serieller Befehle an die Tecan-Pumpe und -Ventile verwendet wird, wurde aus einem Open-Source-Python-Paket29 übernommen. Protokolle zur Durchführung von Experimenten wurden durch zeitlich abgestimmte Abfolgen von Einheitenaktionen an der Pumpe und den Ventilen entwickelt. Als Benutzer sind die Parameter und Bereiche, die zum Erstellen automatisierter Experimente zur Verfügung stehen, in Tabelle 1 aufgeführt. In dieser Architektur bietet die IoT-Verbindung die Möglichkeit, Experimente aus der Ferne durchzuführen, während lokal auf dem Gerät ausgeführte Zeitpläne die Betriebssicherheit im Falle einer instabilen Internetverbindung gewährleisten Verbindung.

Abbildung 4 beschreibt den Herstellungs- und Montageprozess des PDMS-Mikrofluidikchips. Der optisch transparente Glas-PDMS-Mikrofluidikchip hat die Grundfläche einer 24-Well-Platte (85,5 mm × 127,6 mm) und lässt sich in Laborgeräte wie Mikroskope, Plattenlesegeräte und Roboterspender integrieren. Die 24 isolierten Wells sind über 2 mm große quadratische Kanäle an der Glas-PDMS-Schnittstelle adressierbar. Für eine bequeme Zugänglichkeit sind alle Einlässe in einer Reihe am Rand der Chipoberfläche und alle Auslässe in einer Reihe am gegenüberliegenden Rand angeordnet. Das Mikrofluidik-Design mit offenem Kreislauf enthält hier Wells, die zur Luft hin offen sind. Auf diese Weise werden im System angesammelte Blasen erschöpft, es findet ein freier Gasaustausch mit der Inkubatorumgebung statt und Organoide sind während der Chipbeladung und dem Abschluss des Experiments leicht zugänglich. Jede Vertiefung fängt 120 \(\upmu \hbox {L}\) ein, die als Mikroumgebung verwendet werden können, einschließlich der Verwendung extrazellulärer Gerüste. Der Einlass und der Auslass der Fluidkanäle befinden sich 5 mm über dem Boden der Vertiefung, wodurch das Risiko verringert wird, dass eine nicht anhaftende Probe in den Ausflusskanal gelangt.

Herstellung des PDMS-Mikrofluidikchips. (A) Grafische Darstellung des ineinandergreifenden Formmusters für das PDMS-Substrat in der mikrofluidischen Chipbaugruppe. (B) Ineinandergreifende Halterungen (blau, rot und grün) werden an der Basisform (lila) befestigt und definieren mikrofluidische Geometrien auf dem gegossenen PDMS, die beim Aushärten des Substrats erhalten bleiben. (C) Das PDMS-Substrat wird aus der Form entfernt und mit Glas verbunden. (D) Eine Querschnittsdarstellung des Chips. Die Flüssigkeit tritt über mikrofluidische Einlässe an der Oberfläche ein und folgt durch Glas am Boden versiegelten Kanälen zu Vertiefungen mit offenem Zugang von oben. (E) Eine 3D-gedruckte Fluidschnittstellenplatte (gelb) verbindet 24 Fluidmikroröhrenleitungen mit den Ein-/Auslässen des Mikrofluidikchips. (F) Mikrofluidischer Chip (Mitte) mit einem Beispiel der Fluidschnittstellenplatte (links) und der vollständig installierten Fluidschnittstellenplatte (rechts).

Jede 3D-gedruckte Fluidschnittstellenplatte verbindet gleichzeitig 24 Leitungen (Abb. 4F). Dies ist eine Vereinfachung im Vergleich zum Einfügen jeder Zeile einzeln, was bei PDMS-basierten Mikrofluidiken üblich ist. Innerhalb der Rohreinsätze der Fluidschnittstellenplatte dichten drei kreisförmige Widerhaken die Tygon-Schläuche an starren Vorsprüngen ab. Die rohrtragenden starren Vorsprünge richten sich nach den Kanalzugangslöchern des Mikrofluidikchips aus. Wenn die Sammlung von 24 Leitungen mit den geformten Löchern im PDMS zusammenpasst, bilden sich Bohrungsdichtungen mit allen Plattenvorsprüngen und die Plattformrohrleitungen werden an den Kanälen des Mikrofluidikchips ausgerichtet.

Am 12. Tag der Entwicklung wurden zerebrale Organoidkulturen von Orbitalschüttlern (Abb. 5A) in automatisierte Mikrofluidikbrunnen (Abb. 5B) übertragen. Der Orbitalschüttler hält ein quasistationäres Geschwindigkeitsregime von etwa 0,12 m/s30,31,32 aufrecht. Wir haben eine Computational Fluid Dynamics-Simulation (CFD) mit Comsol Multiphysics33 (Abb. 5C) durchgeführt, die die ersten 2,2 s der Medieninjektion in das Bohrloch darstellt. Die Flüssigkeit tritt am Einlass 5 mm über dem Glasboden ein und gelangt über eine geneigte Wand in den Schacht. Die Simulation beginnt mit einer Medienflüssigkeitsdomäne, die bis zur Höhe der Einlass-/Auslassöffnungen gefüllt ist und über der sich eine Luftdomäne befindet. Beim Zuführen dringt das Medium in den Hohlraum ein und erzeugt eine Welle, die sich vom Einlass zum Auslass ausbreitet. Das als Kugel modellierte Organoid, das 5 mm unter der Luft-Medien-Grenzfläche befestigt ist, nimmt den Großteil der erzeugten Turbulenzen nicht wahr. Das untere (Glas-)Substrat erfährt während der Zufuhr \(<5\%\) der maximalen Geschwindigkeit. Die Geschwindigkeiten in diesem Regime sind augenblicklich (im Gegensatz zum quasistationären Zustand) und zwei Größenordnungen geringer als die von Orbitalschüttlern, was zu niedrigeren Geschwindigkeiten und einer geringeren Scherbelastung der Kultur führt. Einer der Vorteile dieses Systems besteht darin, dass Forscher die Medienflussrate und den Lieferplan so anpassen können, dass eine optimale Diffusion der Nährstoffe bei minimaler Störung des Organoids erreicht wird.

Die rechnergestützte Fluiddynamik simulierte mithilfe des automatisierten Systems den Fluss in den einzelnen Gewebekulturvertiefungen. (A) Organoidkulturen werden auf Wellplatten erweitert, die auf einem Orbitalschüttler gedreht werden. (B) Nach 12 Tagen werden Organoide in den automatisierten Mikrofluidikbrunnen verpflanzt. (C) Ein Brunnen des vorgeschlagenen automatisierten Systems mit konstanter Flüssigkeitseinspritzung über 2 s mit Geschwindigkeitsstromlinien.

Das Wachstum zerebraler Organoide unter Autokultur wurde in einem 18-tägigen Experiment mit dem Wachstum unter Orbitalschüttlerbedingungen verglichen. Menschliche pluripotente Stammzellen wurden zu Organoiden aggregiert und während der ersten 12 Tage während der neuronalen Induktion unter Standardbedingungen gehalten (siehe „Methoden“). Die Charge wurde aufgeteilt und 12 Organoide wurden auf einen Mikrofluidikchip von Autoculture geladen, während der Rest als Kontrollen in einer 6-Well-Platte auf einem Orbitalschüttler aufbewahrt wurde. Jede Vertiefung wurde unmittelbar vor dem Laden der Organoide mit 50 \(\upmu \hbox {l}\) Matrigel vorbeladen, um jedes Organoid in der Mitte der Vertiefung zu befestigen (siehe „Methoden“). Die automatisierten Organoide wurden sechs Tage lang stündlich mit 70 \(\upmu \hbox {L}\) gefüttert, während die Kontrollen jeden zweiten Tag mit 2 ml gefüttert wurden. Bei der Automatisierung muss die Wellplatte zum Füttern nicht regelmäßig aus dem Inkubator entfernt werden; Daher eignet sich dieses System gut für die Längsüberwachung der Organoidentwicklung. In dieser Studie wurden Organoide in der Autokultur-Wellplatte einmal pro Stunde mithilfe einer Hellfeld-Bildgebungsplattform im Inkubator überwacht34,35.

Abbildung 6A zeigt die automatisierte mikrofluidische Kulturplatte in einem Inkubator, der auf einem ferngesteuerten, IoT-fähigen, automatisierten Multiwell-Bildgebungssystem platziert ist. Das Bildgebungssystem wurde entwickelt, um biologische Experimente in einem 24-Well-Plattenformat zu überwachen, wobei für jedes Well eine eigene Kamera verwendet wird. Um die dreidimensionale Entwicklung der Organoide während des gesamten Experiments zu berücksichtigen, haben wir Bildserien aufgenommen, die den Bereich der Brennweiten abdecken und das gesamte dreidimensionale Gewebe abdecken. Ein Computer-Vision-Algorithmus wurde verwendet, um die fokussierten Merkmale in jeder Fokusebene zu erkennen, ein zusammengesetztes Bild zu erzeugen, das die fokussierten Merkmale im gesamten Organoid maximiert, und die projizierte Fläche zu berechnen. Dieser Prozess ist in früheren Arbeiten35 beschrieben. Abbildung 6B zeigt 12 Organoidkulturen der Großhirnrinde (Tag 12), die in einzelne Vertiefungen des Mikrofluidikchips geladen und parallel auf der Autokulturplattform für das Experiment gefüttert werden. Abbildung 6C,D zeigen das Wachstum von „Kultur 4“ über sechs aufeinanderfolgende Tage. Bei den Organoiden in den Autokultur-Vertiefungen wurde ein robustes Organoidwachstum beobachtet, das mit der Größenzunahme übereinstimmte, die bei den unter Kontrollbedingungen gezüchteten Organoiden beobachtet wurde. Im Vergleich zu Kontrollen entwickelten automatisierte Organoide tatsächlich einen weniger dichten Umfang, was darauf hindeutet, dass die Verringerung der Geschwindigkeiten und Scherkräfte Wachstum und Migration berücksichtigen könnten, die andernfalls gespalten würden.

Am 18. Tag wurden die Kulturen geerntet und mittels Massen-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und Immunhistochemie analysiert, um die in den einzelnen Bedingungen erzeugten Zelltypen und den allgemeinen Gesundheitszustand der Zellkulturen zu bewerten. Die Transkriptome von 7 „Automatisierten“ und 4 „Suspensions“-Organoiden wurden verglichen. Die Genexpression von Zelltypmarkern für Neuralepithelien (SOX2), radiale Glia-Neuralstammzellen (SOX2, HES5, PAX6, HOPX), intermediäre Vorläuferzellen (EOMES) und unreife Neuronen (NeuroD1, RELN) zeigte keine konsistenten Unterschiede zwischen der Autokultur und Kontrollproben, die darauf hindeuten, dass die allgemeine Differenzierungstreue durch die Verwendung des Autokultursystems nicht beeinträchtigt wurde (Abb. 7A). In Übereinstimmung damit sahen wir durch Immunhistochemie eine robuste Expression der neuralen Vorläuferproteinmarker SOX2 und Nestin in Abschnitten von Organoiden, die unter Standard- oder Autokulturbedingungen gezüchtet wurden (Abb. 7B).

Längsüberwachung der Organoidentwicklung. (A) Der mikrofluidische Chip von Autoculture sitzt auf einem ferngesteuerten, IoT-fähigen, automatisierten 24-Well-Bildgebungssystem. (B) Hellfeldbilder von zwölf einzelnen 12 Tage alten Kulturen der Großhirnrinde am ersten Tag der automatisierten Fütterung. (C) Längsbildgebung von „Kultur 4“ während des Experiments. (D) Projizierte Flächenausdehnung von „Kultur 4“ während des Experiments. Dies wurde mithilfe eines Computer-Vision-Algorithmus34 ermittelt.

Im Vergleich zu automatisierten Organoiden und Kontrollorganoiden beobachteten wir einen signifikanten Unterschied in der Expression von Genen, die mit Zellkulturstress verbunden sind. Studien haben gezeigt, dass die Glykolyse und die Stresswege des endoplasmatischen Retikulums (ER-Stress) in Organoiden im Vergleich zu In-vivo-Gewebeproben hochreguliert sind und dass diese mit einer beeinträchtigten Spezifikation und Reifung des Zellsubtyps korrelieren17,19. In dieser Studie war die kanonische Glykolyse der wichtigste deferentielle Weg, wobei die überwiegende Mehrheit der signifikanten Gene durchgehend herunterreguliert wurde (siehe Ergänzungstabellen 2 und 3). Gene, die in zerebralen Organoiden besonders hochreguliert sind, zeigten verringerte Werte im Automatisierungszustand: ALDOA, ENO1, HK1 und PGK1 wiesen Faltungsänderungen von –6,9, –10,4, –2,8 bzw. –9,3 auf (Abb. 7A). Darüber hinaus wurden die Marker für ER-Stress: ARCN1, GORASP2 und YIPF1 durch fache Änderungen von –2,8, –2,2 bzw. –3,0 reduziert. In der Ergänzungstabelle 4 finden Sie respektvoller exprimierte Gene für ER-Stress.

Ergebnisse der Transkription und Immunfluoreszenzbildgebung. (A) Paarweise Vergleiche der Expression ausgewählter Gene, die mit neuronaler Differenzierung, Glykolyse und ER-Stress verbunden sind. Die Ergebnisse waren statistisch signifikant mit einem angepassten p-Wert ≤ 0,05, mit Ausnahme von HOPX und NES der neuronalen Differenzierung. Die „Automatisierten“ Daten repräsentieren 7 biologische Replikate und die „Suspension“-Daten repräsentieren 4 biologische Replikate mit 6 technischen Replikaten (B). Immunfluoreszenzfärbungen für SOX2, Nestin und DAPI von Suspensions- und automatisierten Organoidschnitten zeigen kongruente Vorläufermarker.

Die steigenden Anforderungen an Langzeitexperimente, Reproduzierbarkeit, Parallelisierung und Längsschnittanalyse treiben die Zellkultur in Richtung Automatisierung. Diese Studie stellt eine automatisierte, mikrofluidische Lösung für das Wachstum und die Erhaltung von Organoiden vor, die in Verbindung mit anderen Steuerungs- und Sensorgeräten über das Internet der Dinge existieren können, wodurch die Möglichkeit vergrößert wird, Präzisionsrobotik für automatisierte Experimente zu nutzen. Durch die Kombination dieser Plattform mit der hier gezeigten Bildgebungsplattform (Abb. 6) entsteht eine stationäre Umgebung, die auf einzigartige Weise die Live-Untersuchung einzelner Organoide im Laufe der Zeit ermöglicht. Diese Plattform könnte problemlos zur Pflege anderer Organoidmodelle und Ex-vivo-Gewebe verwendet werden. Der hier beschriebene 24-Plex-Mikrofluidik-Chip könnte auch so angepasst werden, dass er das Wachstum adhärenter (2D) Kulturen unterstützt, indem ein zusätzlicher Protokollschritt zur Behandlung des Mikrofluidik-Chips mit einer Zelladhäsions-Oberflächenbeschichtung vor dem Laden von Zellen aufgenommen wird.

Der Einsatz von Orbitalschüttlern für die Langzeitkultur von Organoiden ist auf diesem Gebiet weit verbreitet und bietet Vorteile für die Nährstoffdiffusion und die Homogenität gelöster Gase. Die vorhandenen Flüssigkeitsgeschwindigkeiten und Scherkräfte ähneln jedoch nicht der embryonalen Umgebung. Mikrofluidik wie in dem hier gezeigten System könnte verwendet werden, um Flüssigkeitsgeschwindigkeiten, Scherkräfte und Druckgradienten abzustimmen und gleichzeitig durch schnelle Fütterungspläne die gleichen Vorteile für die Konzentration von Nährstoffen und gelösten Gasen zu erzielen. Unser System ermöglicht eine Umgebung mit niedrigen Geschwindigkeiten. Die hier gezeigte CFD-Simulation (Abb. 5) stellt die im Validierungsexperiment herrschenden Bedingungen dar, die bevorzugt für niedrige Geschwindigkeiten ausgewählt wurden; Allerdings würden höhere Füllraten zu höheren Geschwindigkeitsgradienten führen, die zur Untersuchung der Auswirkungen auf die Organoidmorphologie und -differenzierung verwendet werden könnten.

Die Reduzierung des Stressniveaus in zerebralen Organoidmodellen ist entscheidend, um physiologische Relevanz zu erreichen. Gemessen an der verringerten Expression glykolytischer Enzyme führt die Umgebung der Autokulturplattform im Vergleich zu herkömmlichen Suspensionskulturbedingungen zu Organoiden mit geringerem Stress. Wege, die auf Umweltbedingungen wie Zuckerstoffwechsel, Hypoxieüberwachung und Proteinproduktion reagieren, sind durch den integrierten Stressreaktionsweg miteinander verbunden. Durch die Reduzierung von Konzentrationsschwankungen in den Zellkulturmedien durch automatisierte Fütterung kann eine stärkere Homöostase der Kulturen erreicht werden. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die möglichen langfristigen Auswirkungen einer Verringerung der Genexpression von Glykolyse- und ER-Stressgenen sowie die kritischen Umweltbedingungen zu verstehen, die der von uns beobachteten Genexpressionssignatur im Zusammenhang mit weniger Zellstress zugrunde liegen. Es ist beispielsweise unklar, ob der Mangel an essentiellen Nährstoffen wie Glukose oder die Anreicherung von Zellmetaboliten wie Laktose der entscheidende Faktor ist, der zur Induktion von Genen im Glykolyseweg führt, der unter Standardbedingungen für Organoidkulturen beobachtet wird. Das hier entwickelte Autokultursystem bietet jedoch eine Plattform, auf der wir diese Frage systematisch untersuchen können.

Zellkulturmedien wurden in Glasflaschenreservoirs (Corning) mit einem Lösungsmittelabgabedeckel mit mehreren Anschlüssen (Spex VapLock) aufbewahrt und für die Dauer des Experiments bei \(4^{\circ }\hbox {C}\) gelagert. Jede Reservoir-Abgabekappe enthielt ein einzelnes Tygon-Mikrobohrungsrohr mit einem Innendurchmesser von 0,030 Zoll und einem Außendurchmesser von 0,090 Zoll (Masterflex), das durch einen zweiteiligen PTFE-Mutter- und Ferrulen-Gewindeadapter (Spex VapLock) abgedichtet war und sich vom Boden des Reservoirs bis zu einem Einlassanschluss erstreckte den 6-Port-Keramikventilkopf der Spritzenpumpe (Tecan Cavro Centris, 1,0-ml-Glasfläschchen). Durch einen 0,22-\(\upmu \hbox {m}\)-Filter (Millipore), der an der Kappe angebracht ist, kann sterile Luft das Reservoir auffüllen, um den Reagenzentzug der Spritzenpumpe auszugleichen. Für den Anschluss der Spritzenpumpe an zwei parallele 12-Port-Verteilerventile (Tecan SmartValve) wurden die gleichen Tygon-Mikrobohrungsschläuche und PTFE-Mutter- und Ferrulen-Gewindeadapter verwendet. Jedes vom Verteilerventil ausgehende Tygon-Mikrobohrungsrohr (Masterflex) mit einem Innendurchmesser von 0,020 Zoll und einem Außendurchmesser von 0,060 Zoll ist mit einer einzelnen Vertiefung des Mikrofluidikchips verbunden. Ab dieser Verbindung bleibt die Fluidisolation zwischen den Bohrlöchern erhalten. Jedes 12-Port-Verteilungsventil bedient sechs Wells auf dem Mikrofluidik-Chip. Es wurden Systeme mit zwei und vier Verteilerventilen konstruiert. Die Sammlung von 2 m langen Microbore-Röhrchen wurde zur bequemen Handhabung zu einem Geflecht gebündelt und durch die hintere Eingangsöffnung eines Standard-Zellkulturinkubators (Panasonic) geführt (Abb. 2(4)). Unter Inkubatorbedingungen (\(37^{\circ }\hbox {C}\), 5 % CO2, 95 % relative Luftfeuchtigkeit) passte eine einzelne kundenspezifische, 3D-gedruckte Fluidschnittstellenplatte zum Satz Mikrobohrungsröhrchen für die Reagenzienabgabe an die Einlässe des Mikrofluidik-Chips angeschlossen und eine zweite, identische Schnittstellenplatte passte den Satz Mikrobohrungsröhrchen für die Reagenzienansaugung an die Auslässe an.

Die Mikrobohrungsröhrchen für die Aspiration wurden aus dem Inkubator zurück in einen Satz konischer Einwegröhrchen mit 15 ml Fassungsvermögen (Falcon) zur Sammlung konditionierter Medien geführt (Abb. 2(3)). Jedes Sammelreservoir war mit einem Gummistopfen (McMaster) verschlossen, der zwei 0,06 Zoll große Bohrlöcher enthielt. Für jeden Stopfen wurde das Mikrobohrungsrohr, das konditionierte Medien vom Mikrofluidikchip lieferte, in ein Loch eingeführt, und ein trockenes Mikrobohrungsrohr für den pneumatischen Betrieb, der zurück zum Aspirationsverteilungsventilkopf führt, wurde in das andere Loch eingeführt. Die Spritzenpumpe wurde verwendet, um in jedem Sammelreservoir nacheinander einen Unterdruck zu erzeugen, um konditionierte Medien vom Mikrofluidikchip in das Sammelreservoir zu ziehen. Durch die Trennung zwischen der Pneumatikleitung und der Leitung für konditionierte Medien wurde der Medienzufluss im Sammelbehälter aufgefangen. Alle Microbore-Röhrchen waren mit PTFE-Muttern und Ferrulen-Gewindeadaptern hermetisch am Verteilerventil und an der Spritzenpumpe abgedichtet.

Die Spritzenpumpe und die Verteilerventile wurden mithilfe der im Tecan-Handbuch beschriebenen elektrischen Verkabelungskonfiguration für mehrere Pumpen angeschlossen. Ein Rechenmodul (Raspberry Pi 4) leitete serielle Kommunikation mit Tecan OEM Communication Protocol über ein GPIO TX/RX an die serielle DB9M RS232-Erweiterungskarte für Raspberry Pi (Ableconn) weiter. Das Rechenmodul des Raspberry Pi nutzte ein 7-Zoll-Touchscreen-Display zum Bearbeiten und Starten von Protokollen. Zur Entwicklung der für die Ausführung von Protokollen in der Automatisierung erforderlichen Software wurde eine Open-Source-Python-Anwendungsprogrammschnittstelle (API) verwendet29.

PDMS-basierte Mikrofluidik wurde mithilfe einer ineinandergreifenden 3D-gedruckten Kunststoffform konstruiert (Abb. 4). Diese wurden mit einem SLA-Drucker (Formlabs Form 3) mit Harz Modell V2 gedruckt. Die gedruckten Formen wurden 20 Minuten lang mit Ultraschall in Isopropanol (IPA) nachbearbeitet, um überschüssiges Harz zu entfernen, und anschließend in N2 getrocknet. Trockene Komponenten wurden unter UV-Licht (405 nm) 30 Minuten lang bei \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) ausgehärtet. Wie in Abb. 3 dargestellt, wurden die Formteile zusammengebaut und mit PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) gefüllt, das durch Mischen von PDMS-Präpolymer und einem Härter (10:1 Gew./Gew.) hergestellt wurde. Nach dem Befüllen der Form wurde das PDMS 1 Stunde lang in einer Vakuumkammer entgast. Die mit PDMS gefüllte Form wird 24 Stunden lang bei \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) aushärten gelassen, bevor das PDMS aus der Form entfernt wird.

Borosilikatglassubstrate (\(101,6\hbox {mm} \times 127,0\hbox {mm}\, McMaster-Carr) wurden durch Ultraschallbehandlung in Aceton (10 Min.), dann Isopropylalkohol (10 Min.) gereinigt und mit N2 getrocknet . Das Glassubstrat und die geformte PDMS-Oberfläche wurden 45 s lang mit Sauerstoffplasma bei 50 W aktiviert. Das Glas und das PDMS (Abb. 4C) wurden von Hand ausgerichtet, zusammengepresst und bei \(100\,^{\circ }\hbox {C}\) auf einer Heizplatte 30 Minuten lang gebacken, wodurch eine irreversible Versiegelung entstand.

Eine 10 \(\upmu \hbox {m}\)-Schicht aus Parylene-C (Specialty Coating Systems) wurde auf dem Mikrofluidikchip abgeschieden, um die PDMS-Absorption kleiner Moleküle zu verhindern. Zur Förderung der Haftung wurden zwei Tropfen Silan A-174 (Sigma-Aldrich) in die Abscheidungskammer gegeben.

Die Fluidschnittstellenplatte (Abb. 4F) wurde 3D-gedruckt, um den Mikrobohrungsschlauch mit 2,2 mm Außendurchmesser (Cole-Palmer) mit den PDMS-Einlass- und Auslassmerkmalen zu verbinden. Jede Verbindungsgeometrie bestand aus 24 zylindrischen Extrusionen mit einem Außendurchmesser von 2,7 mm und einer Bohrung von 2,2 mm. In jeder Bohrung befanden sich drei 0,2 mm lange Widerhaken, um den Mikrobohrungsschlauch beim Einführen festzuhalten. Diese Komponente wurde mit einem Formlabs SLA-Drucker (Form 2) mit Surgical Guide-Harz unter Ultraschallbehandlung in Isopropanol (IPA) für 20 Minuten gedruckt, um überschüssiges Harz zu entfernen, und anschließend in N2 getrocknet. Anschließend wurden die trockenen Komponenten unter UV-Licht (405 nm) für 30 Minuten bei \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) ausgehärtet. Um die Biokompatibilität sicherzustellen, wurde das Teil mit 5 \(\upmu \hbox {m}\) Parylene-C (Specialty Coating Systems) beschichtet. Zwei Tropfen Silan A-174 (Sigma-Aldrich) wurden ebenfalls mit dem Gerät in die Abscheidungskammer geladen, um die Haftung zu fördern.

Die Sterilisation der Spritzenpumpe, der Ventilköpfe, der Schläuche, der Fluidschnittstellenplatten und der Sammelröhrchenkappen wurde gemäß der Empfehlung des Lieferanten (Tecan) durchgeführt. Eine 10-minütige Wäsche mit 70 % Ethanol aus einem autoklavierten Glasreservoir wurde mit der Spritzenpumpe durch die Plattform zu den Sammelreservoirs gedrückt. Nach 70 % Ethanol wurde 10 Minuten lang ein Trocknungszyklus mit steriler Luft durchgeführt, die durch einen 0,22 \(\upmu \hbox {m}\)-Filter (Millipore) zugeführt wurde. Zehn aufeinanderfolgende Zyklen mit entionisiertem, keimfreiem Wasser und Trocknung wurden unter denselben Parametern durchgeführt. Der mikrofluidische Chip und die Medienreservoirs wurden 45 Minuten lang bei \(121^{\circ }\hbox {C}\) autoklaviert und unmittelbar vor der Verwendung 15 Minuten lang getrocknet. Alle Komponenten wurden über versiegelte autoklavierbare Beutel zur Organoid- und Medienbeladung in eine Biosicherheitswerkbank in Gewebekultur überführt. Vorbereitete, ergänzte Medien wurden in jedes Medienreservoir überführt, verschlossen (VapLock) und dann für die Dauer des Experiments im Kühlschrank gelagert.

Die humane embryonale Stammzelllinie H9 (WiCell, an der Quelle authentifiziert) wurde auf mit rekombinantem humanem Vitronectin (Thermo) beschichteten Zellkulturschalen in StemFlex Medium (Gibco) gezüchtet. Die Subkultivierung wurde durchgeführt, indem die Platten 5 Minuten lang mit 0,5 mM EDTA inkubiert und dann in Kulturmedium resuspendiert wurden, um sie auf neue beschichtete Platten zu übertragen.

Um zerebrale Organoide zu erzeugen, wurden adhärente Kulturen mit Accutase Cell Dissociation Reagent (Gibco) in einzelne Zellen dissoziiert und dann in AggreWell 800 24-Well-Platten (STEMCELL Technologies) mit einer Dichte von 3.000.000 Zellen pro Well mit 2 ml AggreWell Medium (STEMCELL Technologies) aggregiert ), ergänzt mit Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632, 10 \(\upmu \hbox {M}\), Tocris, 1254) (Tag 0). Am folgenden Tag (Tag 1) wurde 1 ml des AggreWell-Mediums manuell durch ergänztes Medium mit WNT-Inhibitor (IWR1-\(\varepsilon\), 3 \(\upmu \hbox {M}\), Cayman Chemical, 13659, ersetzt. Tage 1–10) und Nodal/Activin-Inhibitor (SB431542, Tocris, 1614, 5 \(\upmu \hbox {M}\), Tage 1–10). Am zweiten Tag wurden die Aggregate auf einen 37 \(\upmu \hbox {m}\)-Filter (STEMCELL Technologies) übertragen, indem vorsichtig mit einer p1000-Pipette mit breiter Bohrung aus der AggreWell-Platte abgesaugt wurde. Die Organoide wurden durch Umdrehen und Spülen der Filter mit frischem AggreWell-Medium in 6-Well-Platten mit extrem geringer Adhäsion (Corning) überführt. Die Medien wurden an den Tagen 3, 4, 5, 6, 8 und 10 gewechselt, indem manuell 2 ml konditioniertes Medium durch frisches Medium ersetzt wurden. Ab dem 11. Tag wurde das Medium durch Neuronal Differentiation Medium mit Eagle-Medium ersetzt: Nährstoffmischung F-12 mit GlutaMAX-Ergänzung (DMEM/F12, Thermo Fisher Scientific, 10565018), 1X N-2-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific, 17502048) , 1X chemisch definiertes Lipidkonzentrat (Thermo Fisher Scientific, 11905031) und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, ergänzt mit 0,1 % rekombinantem humanem Fibroblasten-Wachstumsfaktor b (Alamone F-170) und 0,1 % rekombinantem humanem epidermalen Wachstumsfaktor (R & D Systems 236). -Z.B).

Die „Suspensions“-Organoide der Kontrollgruppe blieben in 6-Well-Platten suspendiert und wurden für den Rest der Kultur jeden zweiten Tag mit 2 ml Medienwechsel gehalten. „Automatisierte“ Organoide der Versuchsgruppe wurden auf den Mikrofluidik-Chip geladen und erlebten für den Rest der Kultur einmal pro Stunde einen Medienwechsel von 70 \(\upmu \hbox {L}\).

Am 12. Tag der zerebralen Organoiddifferenzierung wurde der mikrofluidische Chip durch Pipettieren von 50 \(\upmu \hbox {L}\) gekühltem (ungefähr \(0\,^{\circ }\hbox {C}\)) Matrigel vorbereitet hESC Qualif Matrix (BD 354277) in jede Vertiefung. Unmittelbar nach Matrigel wurden einzelne zerebrale Organoide über eine p1000-Pipette mit großer Bohrung mit 70 µm nativem konditioniertem Medium in jede Vertiefung überführt und zur Bildgebung in der Mitte der Vertiefung positioniert. Der Chip wurde mit einem 24-Well-Plattendeckel abgedeckt und 15 Minuten lang bei \(37^{\circ }\hbox {C}\) inkubiert, um das Matrigel auszuhärten. Jede Vertiefung wurde mit weiteren 70 µm frischem Medium gefüllt und mit Fluidschnittstellenplatten (Abb. 4F) verbunden, die über eine hintere Zugangsöffnung in den Inkubator geführt wurden. Die Fluidschnittstellenplatten wurden per Hand in den Mikrofluidikchip eingepasst und der Chip wurde auf der Bildgebungsplattform positioniert (falls zutreffend).

Das Smart-seq2-Protokoll36 wurde verwendet, um cDNA-Sequenzierungsbibliotheken voller Länge aus vollständiger organoider mRNA zu generieren. Kurz gesagt, ganze Organoide wurden unter Verwendung von Lysepuffer lysiert, um Zelllysat zu erzeugen, das polyadenylierte mRNAs enthielt, die mit Superscript III (ThermoFisher Scientific) unter Verwendung eines OligoDT-Primers (/5Me-isodC/AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN) revers transkribiert wurden, und der Template-Wechsel wurde mit einem Template-Switch-Oligo durchgeführt (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG). Die OligoDT-Primer- und Template-Switch-Oligosequenzen dienten als Primerstellen für die nachgeschaltete cDNA-Amplifikation (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT). Die cDNA wurde mit einem hochempfindlichen fluorometrischen Qubit 3.0-DNA-Assay quantifiziert, und die Qualität wurde mit einem hochempfindlichen Bioanalysator-DNA-Kit (Agilent) bewertet. Nextera HT-Transposase (Illumina) wurde verwendet, um 1 ng cDNA in Barcode-Sequenzierungsbibliotheken umzuwandeln.

Paired-End-Reads wurden mit 75 × 75 bp auf einem Illumina NextSeq 550 sequenziert, und die weitere Tiefe wurde mit 50 x 50 bp auf einem Illumina NovaSeq 6000 sequenziert, um eine durchschnittliche Read-Tiefe von 65 Millionen gepaarten Reads pro Probe zu erreichen. Die Proben wurden mit Illumina i5- und i7-Barcodes demultiplext, und Proben mit größerer Tiefe wurden mit SAMtools37 auf 100 M unterabgetastet. Zugeschnittene Lesevorgänge wurden kombiniert und mit STAR-Alignment38 (Gencode v37) unter Verwendung der toil-rnaseq-Pipeline39 auf das menschliche Genom (hg38 UCSC-Assembly) ausgerichtet. STAR-Parameter stammten aus der DCC-Pipeline von ENCODE40. Die differenzielle Genexpression wurde mit dem DESeq241-Paket in RStudio durchgeführt. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse wurde mit g:Profiler42 durchgeführt.

Zerebrale Organoide wurden gesammelt, in 4 % Paraformaldehyd (ThermoFisher Scientific #28908) fixiert, mit 1X PBS gewaschen und bis zur Sättigung in eine 30 %ige Saccharose (Millipore Sigma #S8501) in PBS-Lösung getaucht. Die Proben wurden in Kryoformen (Sakura – Tissue-Tek Cryomold) mit Gewebegefriermedium (General Data, TFM-C) eingebettet, eingefroren und bei − \(80\,^{\circ }\hbox {C}\) gelagert. Organoide wurden mit einem Kryostat (Leica Biosystems #CM3050) bei 18 \(\upmu \hbox {M}\) auf Glasobjektträger geschnitten. Organoidschnitte wurden dreimal 10 Minuten lang in 1X PBS gewaschen, bevor sie zwei Stunden lang in 10 % BSA in PBS-Blockierungslösung (ThermoFisher Scientific #BP1605-100) inkubiert wurden. Die Schnitte wurden dann in primären Antikörpern, verdünnt in Blockierungslösung, über Nacht bei \(4^{\circ }\hbox {C}\) inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte dreimal 30 Minuten lang mit 1X PBS gewaschen. Anschließend wurden sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Lösung von Sekundärantikörpern, verdünnt in einer Blockierungslösung, inkubiert. Die Schnitte wurden weitere drei Mal 30 Minuten lang in 1X PBS gewaschen.

Die verwendeten Primärantikörper waren: Kaninchen-Anti-SOX2 (ab97959, 1:250-Verdünnung), Hühner-Anti-Nestin (ab134017, 1:250-Verdünnung) und DAPI (Sigma D9542-10 mg). Als Sekundärantikörper wurden verwendet: Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 594 (ab150080, 1:250-Verdünnung) und Ziegen-Anti-Huhn-Alexa-Fluor 488 (ab150169, 1:250-Verdünnung). Die Bildgebung erfolgte mit dem Weitfeldmikroskop Zeiss Axioimager Z2 am UC Santa Cruz Institute for the Biology of Stem Cells (RRID:SCR_021135) und der Software Zen Pro. Bilder wurden mit ImageJ verarbeitet.

Die Fluiddynamik beim Füllen und Entleeren der Brunnen wurde mit der kommerziellen Computational Fluid Dynamics-Software COMSOL®Multiphysics 5.5 (Stockholm, Schweden) vorhergesagt. Abbildung 5B zeigt die ersten 2 s des Füllzyklus (\(70\, {\upmu }\hbox {L}\) von Medien, die mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von \(9,85 \times 10^4\,\hbox {m) gefördert werden /S}\)). Der Brunnen ist \(5\,\hbox {mm}\) tief und hat einen Durchmesser von \(5,6\,\hbox {mm}\). In dieser Simulation waren die Medieneigenschaften \(997\,\hbox {kg/m}^3\) Dichte und \(6,92 \times 10^3\,\hbox {kg/ms}\) Viskosität. Die Simulation sagt die Phasengrenze (zwischen Flüssigkeit und Luft) als freie Oberfläche voraus43. Der Lösungsbereich besteht aus einer starren Wand (dem Well) mit „rutschfesten“ Randbedingungen und einer zum Inkubator hin offenen oberen Oberfläche (der Luft-Medien-Grenzfläche) mit „rutschfesten“ Randbedingungen. Das Organoid wurde als Phantomkugelgeometrie mit einem Durchmesser von \(1,8\,\hbox {mm}\) simuliert. Die atmosphärischen Bedingungen wurden auf einen Druck von \(1\,\hbox {atm}\), eine Temperatur von \(37\,^{\circ }\hbox {C}\) und eine Gaszusammensetzung von \(5) eingestellt \%\) Kohlendioxid, \(17\%\) Sauerstoff und \(78\%\) Stickstoff. Wir haben das Geschwindigkeitsfeld im zentralen vertikalen Querschnitt des Bohrlochs mithilfe von Strompfeillinien visualisiert. Die Simulation verwendete insgesamt 519.830 tetraedrische Elemente.

Sequenzierungsdaten für polyadenylierte RNA wurden in GSE207894 hinterlegt. Weitere differenzielle Expressionsdaten aus Abb. 7A sind in den Ergänzungstabellen 1–4 verfügbar.

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Diese Arbeit wurde vom Schmidt Futures SF 857 und dem National Human Genome Research Institute unter der Preisnummer 1RM1HG011543 (DH, SRS und MT), dem National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter der Preisnummer R01MH120295 (SRS) und Defense Advanced unterstützt Research Projects Agency (DARPA), Army Research Office, im Rahmen der Kooperationsvereinbarung Nr. W911NF-18-2-0104, und des Innenministeriums, Auszeichnung Nr. D20AC00003. (MR und MT), der National Science Foundation unter der Auszeichnungsnummer NSF 2034037 (REG, SRS und MT) und NSF 2134955 (MT, SRS und DH). DH ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute. Die Autoren möchten Pattawong Pansodtee, David Parks und Matt Elliott für Diskussionen sowie der IBSC Cell Culture Facility (RRID:SCR 021353) und dem UCSC Life Sciences Microscopy Center (RRID:SCR 021135) für wertvolle Ressourcen und Unterstützung danken .

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Gary L. Blankets, Ryan N. Hoffman und Sophie R. Salama

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, University of California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, USA

John Selberg, Sergio Lamb, Sebastian Torres-Montoya, Peter V. Baudin, Victoria T. Ly, Finn Amend, Marco Rolandi und Mircea Theodorescu

Howard Hughes Medical Institute, University of California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, USA

David Haussler

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STS, JS, SC und FA entwickelten die automatisierte mikrofluidische Zellkulturplattform. GLM und RNH stellten Zellkulturen zur Verfügung. STS und GLM führten die Experimente und die Transkriptomanalyse durch. STM entwickelte die numerische Strömungssimulation PVB und VTL führte die Bilderfassung und -analyse durch. LT und RNH führten eine immunhistochemische Färbung durch. STS hat die Fotos und Zeichnungen für die Figuren erstellt. MR, DH, SRS, REG und MT betreuten das Team und stellten die Finanzierung sicher. Alle Autoren haben zum Verfassen des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Sofie R. Salama oder Mircea Teodorescu.

STS und GLM sind Gründer von OrganOmics, einem Unternehmen, das möglicherweise von der im beiliegenden Papier beschriebenen Forschung betroffen ist. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Seiler, ST, Mantalas, GL, Selberg, J. et al. Modulare automatisierte mikrofluidische Zellkulturplattform reduziert glykolytischen Stress in Organoiden der Großhirnrinde. Sci Rep 12, 20173 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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Eingegangen: 12. Juli 2022

Angenommen: 08. September 2022

Veröffentlicht: 23. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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