Strukturelle und funktionelle Analyse des Molch-Lymphsystems

Jan 30, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6902 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Regenerationsfähige Wirbeltiere wie Molche und Salamander besitzen ein geschwächtes adaptives Immunsystem, das durch mehrere Verbindungen zwischen dem Lymphsystem und dem Blutgefäßsystem, den sogenannten Lymphherzen, gekennzeichnet ist. Die Rolle des Lymphgefäßsystems und dieser lymphatisch-venösen Verbindungen bei der Regeneration ist unbekannt. Wir verwendeten in vivo Nahinfrarot-Lymphangiographie, Ultrahochfrequenz-Ultraschall, Mikro-CT-Lymphangiographie und histologische Serienschnitte mit dreidimensionaler Computerrekonstruktion, um die Lymphgebiete von Cynops pyrrhogaster zu bewerten. Mithilfe unseres Modells und der Supermikrochirurgie haben wir gezeigt, dass Lymphherzen für die Lymphzirkulation und die Regeneration der Gliedmaßen nicht unbedingt erforderlich sind. Stattdessen besitzen Molche ein neuartiges intraossäres Netzwerk von Lymphgefäßen im Knochen, das VEGFR-3, LYVE-1 und CD-31 exprimiert. Wir konnten jedoch keine Prox-1-Expression in diesen Gefäßen nachweisen. Wir zeigen, dass das Knochenmark erwachsener Molche sowohl als Lymphdrainageorgan als auch als Fettreservoir fungiert. Diese Studie deckt die grundlegenden anatomischen Unterschiede zwischen dem Immunsystem von Urodellen und Säugetieren auf und bietet ein Modell für die Untersuchung von Lymphgefäßen und Regeneration.

Das Lymphsystem besteht aus einem Netzwerk von Lymphgefäßen, Lymphgewebe und Lymphorganen, die einen wichtigen Teil des Immunsystems bei Wirbeltieren bilden. Lymphgefäße beginnen als blind endende Gefäße im Gewebe und bilden ein ausgedehntes Netzwerk im gesamten Körper, wurden jedoch bisher weder in der Epidermis, im Knorpel noch im gesunden Knochen identifiziert. Alle Lymphgefäße fließen letztendlich über direkte Lymph-zu-Venen-Verbindungen (lymphatisch-venös) in den Blutkreislauf.

Das Lymphsystem reguliert die Umgebung der Zellen im Gewebe, indem es die Verfügbarkeit von Flüssigkeit, Makromolekülen und weißen Blutkörperchen kontrolliert und so eine wichtige Brücke zwischen den Zellen, der extrazellulären Matrix und dem Blutgefäßsystem bildet. Neben ihrer traditionell anerkannten Rolle beim extrazellulären Flüssigkeitstransport haben neuere Studien gezeigt, dass Lymphgefäße auch eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung, der Immunität, dem Fettstoffwechsel, der Krebsmetastasierung sowie bei Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen spielen1,2,3,4,5,6. Ein Versagen der Regeneration der Lymphgefäße nach einer Verletzung führt zu einem Lymphödem, einer entstellenden Krankheit, die durch fortschreitende Schwellung der Gliedmaßen, Fettablagerungen und wiederholte Cellulitis-Infektionen gekennzeichnet ist und weltweit über 200 Millionen Menschen betrifft und für die es keine bekannte Heilung gibt7.

Trotz der wachsenden Literatur über die Bedeutung der Lymphgefäße bei der Wundheilung und bei Krankheiten ist die Rolle des Lymphsystems bei der Regeneration noch wenig untersucht. Ein Hauptgrund dafür ist das mangelnde Wissen über das Lymphsystem bei Urodele-Amphibien (Molche und Salamander), die aufgrund ihrer unübertroffenen Regenerationsfähigkeit allgemein als die besten Modelle für die Regeneration von Wirbeltieren gelten8. Ein Großteil des aktuellen Wissens über die Urodele-Lymphgefäße basiert auf Studien, die vor über einem Jahrhundert durchgeführt wurden, und auf Annahmen aus der Anuran-Forschung (Frösche und Kröten)9,10,11.

Das Lymphsystem der Urodele ist durch das Vorhandensein von 8 bis 23 Paaren von Lymphherzen (LH) gekennzeichnet, die sich an den lymphatischen venösen Verbindungen entlang der Länge des Körpers befinden und die Funktion haben, Lymphe in die Venen zu pumpen und den Rückfluss von Blut in die Lymphgefäße zu verhindern8,10,12. LHs kommen nicht nur bei Molchen vor. Anurane haben 2 bis 5 Paare, während Reptilien und Vögel ein Paar besitzen, das bei den meisten Vögeln in der frühen Postembryonalperiode verschwindet10. Säugetiere hingegen besitzen keine LHs, stattdessen wurde der anfängliche venolymphatische Plexus, der sich während der Entwicklung des jugularen Lymphsacks bildet, als rudimentäres Homolog des LH13,14 beschrieben. Daher haben postembryonale Säugetiere nur ein Paar lymphatisch-venöser Verbindungen, die allen Tetrapoden gemeinsam sind und sich um die Verbindung der Brustgänge und der Vena subclavia befinden. Diese erheblichen anatomischen Unterschiede in der Lymphzirkulation von Wirbeltieren haben entsprechend erhebliche Auswirkungen auf die Funktion des Lymphsystems.

Die Abnahme der lymphatisch-venösen Verbindungen korreliert bemerkenswert mit einer verminderten Regenerationsfähigkeit bei Wirbeltieren (ergänzende Abbildung i). Beweise für diesen Zusammenhang sind im Lebenszyklus von Anuranen deutlich zu erkennen. Als Kaulquappenlarven haben sie eine identische Lymphstruktur wie die Urodelen mit 8 oder mehr LH-Paaren, was insgesamt mindestens 18 lymphatisch-venöse Verbindungen ergibt (einschließlich der Verbindungen zwischen dem Ductus thoracicus und der Vena subclavia). Während dieser Lebensphase besitzen Kaulquappen wie Urodellen die Fähigkeit, Schwänze, Gliedmaßen und die Augenlinse zu regenerieren15,16,17. Sie durchlaufen dann einen ontogenetischen Rückgang und gehen als Erwachsene in einen Zustand der Regenerationsinkompetenz über, mit einem entsprechenden Rückgang der Anzahl der LHs auf 2 bis 5 Paare15,16,17. Studien am südafrikanischen Krallenfrosch Xenopus laevis haben gezeigt, dass Kaulquappen bis zum Stadium 51 bis 52 in der Lage sind, nach der Amputation ein komplettes Hinterbein mit allen 5 Fingern zu regenerieren17,18. Diese nimmt im Stadium 53 zunehmend auf durchschnittlich 3,7 Ziffern und im Stadium 55 auf 2,5 Ziffern ab, begleitet von einem fortschreitenden Verlust der Sonic-Hedgehog-Expression im regenerierenden Gewebe17,18,19. Nach der Metamorphose beschränkt sich die Regeneration der Hinterbeine auf die Bildung eines Knorpeldorns ohne Finger oder Muskeln18,20. Die Ätiologie dieses fortschreitenden Rückgangs der Regenerationsfähigkeit bei Anuranen und höheren Wirbeltieren wie Säugetieren ist weiterhin unbekannt. Die führende Hypothese führt diesen Rückgang auf die Unterschiede in der Reaktion des Immunsystems auf Verletzungen zurück20,21,22,23,24. Darüber hinaus bleibt unklar, ob das Vorhandensein dieser multiplen lymphatischen Verbindungen die Regeneration gleichermaßen erleichtert.

In dieser Studie haben wir die funktionelle Lymphanatomie des japanischen Feuerbauchmolches Cynops pyrrhogaster definiert. Wir haben anhand unseres Modells gezeigt, dass die lymphatisch-venösen LH-Verbindungen im Gegensatz zu Anuranen nicht für die Lymphzirkulation und für die Regeneration essentiell sind. Stattdessen besitzen Molche ein neuartiges intraossäres Netzwerk von Lymphgefäßen, die den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 (VEGFR-3), den endothelialen Hyaluronan-Rezeptor 1 der Lymphgefäße (LYVE-1) und CD-31 exprimieren, das das oberflächliche und tiefe Lymphnetzwerk verbindet und die Lymphzirkulation aufrechterhält auch nach Entfernung aller LHs. Dies ist der erste Bericht über Lymphgefäße in gesunden Knochen und bietet Einblicke in die grundlegenden anatomischen Unterschiede im Immunsystem der hochregenerativen Urodellen und Säugetiere. Diese Studie liefert auch ein Modell zur Untersuchung der Rolle des Lymphgefäßsystems bei der Regeneration und der Regeneration der Lymphgefäße in Urodelen.

Bemerkenswerterweise gibt es erhebliche Unterschiede in der anatomischen Nomenklatur, die bei Urodelen verwendet wird. Dies ist größtenteils auf den Mangel an Literatur zur Gefäßanatomie von Urodelen und auf historisch widersprüchliche Erkenntnisse früher Forscher zurückzuführen, die noch immer bestehen. Die bahnbrechende Monographie von Francis aus dem Jahr 1934, „The Anatomy of the Salamander“, enthält die bisher detaillierteste anatomische Beschreibung des Gefäßsystems erwachsener Salamander9. Daher steht die in dieser Studie verwendete Nomenklatur im Einklang mit dieser Monographie9.

Wir untersuchten zunächst die Lymphdrainagegebiete in vivo mittels Indocyaningrün (ICG) Nahinfrarot-Fluoroskopie (NIRF) Lymphangiographie, ergänzt durch Ultrahochfrequenz-Ultraschall (UHFUS) und Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) Kontrastlymphangiographie. NIRF hat eine hohe Auflösung, aber eine geringe Eindringtiefe in das Gewebe, während UHFUS (40–70 MHz) für die Messung von Größe und Pulsationsraten nützlich ist, aber eine relativ schlechte Auflösung und eine geringe Eindringtiefe aufweist. Mikro-CT hingegen ermöglicht die Visualisierung tiefer Lymphnetzwerke als Ergänzung zu NIRF und UHFUS. Sammelnde Lymphgefäße wurden funktionell als die größeren Lymphgefäße definiert, die den entfernten Fluss sammeln.

Wir identifizierten 16 Paare seitlicher LHs, die sich auf dem Rücken des Molches von den Schulterblättern bis zur Schwanzbasis befanden, und nummerierten diese jeweils mit LH1 bis LH16. ICG floss 2–5 Minuten nach der Injektion schnell zu den LHs und erreichte nach 10–15 Minuten seinen Höhepunkt. Die Gliedmaßen und der Schwanz wurden durch klar definierte Sammellymphgefäße in spezifische LHs konsequent entleert (Abb. 1a). In der Vorderextremität verlaufen die Lymphgefäße auf der dorsalen Seite der Extremität nach hinten zu einem Achselnetzwerk und fließen dann hauptsächlich in LH2 und LH3 und dann über Verbindungen des Truncus lymphaticus logitudinalis lateralis (TLyLL) in LH1, LH4 und LH5 ab. Lymphkollektoren auf der ventralen Oberfläche verbanden das Achselnetzwerk mit den Kollektoren des Kopfes und der kontralateralen Vorderbeine (Abb. 1b). In ähnlicher Weise verlaufen im Hinterbein zwei Hauptsammellymphgefäße auf dem Rücken nach hinten zum unteren Becken und fließen dann über TLyLL-Verbindungen in LH11 und LH12 und später in LH8, LH9, LH10, ​​LH13, LH14, LH15 und gelegentlich LH16 ab (Abb. 1c). . Sammelgefäße verlaufen ebenfalls nach vorne, kreuzen ventral die Mittellinie und verbinden sich mit einem Netzwerk um die Kloake und mit Sammelgefäßen des kontralateralen Hinterbeins. Der Schwanz wurde von zwei Kollektoren entwässert, die entlang des seitlichen Kamms auf der linken und rechten Seite verliefen und sich nach vorne fortsetzten, um das TLyLL zu bilden, und in LH16 und später in LH15 abflossen (Abb. 1d, e).

Kartierung der Lymphgebiete mittels In-vivo-Indocyaningrün-Nahinfrarot-Fluoroskopie-Lymphangiographie. (a) Diagramm, das die Lymphflussgebiete der Vorderbeine (blau), Hinterbeine (gelb) und des Schwanzes (grün) des Molches zeigt, kartiert mit Indocyaningrün (ICG) Nahinfrarot-Fluoroskopie (NIRF). Die Trunci lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (weiße Pfeilspitzen) verlaufen entlang des Körpers und verbinden alle Lymphherzen (LH) (grüne Kreise). (b) Lymphgefäße der Vorderbeine (blaue Pfeilspitzen) verlaufen vor einem dichten Achselnetz und münden hauptsächlich in LH2 und 3 (grüne Kreise), dann in LH1, 3 und 5. Die Lymphgefäße aus der Achselhöhle kreuzen die Mittellinie auf der ventralen Oberfläche und vereinigen sich die Kollektoren der Kopfregion und der kontralateralen Vorderextremität. Die ICG-Injektionsstellen werden mit roten Pfeilspitzen angezeigt. (c) Die Lymphgefäße der Hinterbeine (gelbe Pfeilspitzen) verlaufen nach hinten und fließen hauptsächlich zu LH11 und LH12 (grüne Kreise), dann zu LH8, 9, 10, 13, 14 und 15. Die Lymphgefäße der Hinterbeine sind mit einem dichten Netzwerk um die Kloake verbunden. Die Lymphgefäße auf der rechten Seite (d) und der linken Seite (e) des Schwanzes (grüne Pfeilspitzen) wurden durch entsprechende ipsilaterale Lymphgefäße entleert, wobei die Hauptsammler auf der linken und rechten Seite einen leicht unterschiedlichen Verlauf nach vorne verliefen, und bildeten dann das TLyLL jede Seite. Lymphflüssigkeit aus dem Schwanz floss über das TLyLL in LH16 (grüner Kreis) und später in LH15. (f) Diagramm, das die Lymphflussgebiete der Vorderbeine (blau) und Hinterbeine (magenta) des Frosches zeigt, kartiert mit ICG NIRF. Die großen subkutanen Lymphsäcke (gelb), die die Extremitätenlymphgefäße und das LH (grüne Kreise) verbinden. (g) Die Hinterbeine des Frosches wurden hauptsächlich durch dorsale Kollektoren (magentafarbene Pfeilspitzen) zu den hinteren LHs (grüne Kreise) entleert, und etwas Flüssigkeit floss zu den großen subkutanen Lymphsäcken (gelber Umriss). Die Lymphgefäße der Vorderbeine flossen schnell in die Lymphsäcke und verdeckten das tiefere Lymphgefäßsystem, bevor sie zu den hinteren linken Lymphgefäßen flossen (blaue Pfeilspitzen). Die ICG-Injektionsstellen werden mit roten Pfeilspitzen angezeigt. Bei Molchen waren keine subkutanen Lymphsäcke zu sehen.

Bei Xenopus erfolgte die Entwässerung der Hinterbeine hauptsächlich durch dorsale Sammler zu den hinteren LHs und Säcken (Abb. 1f, g). In den Vorderbeinen sammelte sich ICG schnell in großen subkutanen Lymphsäcken und verdeckte kleinere Gefäße. Die Flüssigkeit aus den Lymphsäcken floss dann zu den hinteren LHs. Bei Molchen fanden wir keine derartigen Lymphsäcke. Stattdessen sammelte sich überschüssiger Farbstoff in extravaskulären Räumen, insbesondere um das subkutane Gewebe des Beckens und der Achselhöhle sowie entlang von Nervenhüllen, die nicht mit Endothel ausgekleidet waren, was durch das Fehlen der Endothelmarker VEGFR-3, LYVE-1 und CD-31 bestätigt wurde (Ergänzende Abbildungen ii und iii). Bei der Injektion kleiner Mengen Kontrastmittel konnte keine Flüssigkeitsansammlung in diesen Räumen beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass der Lymphfluss in diesen extravaskulären Bahnen nur eine begrenzte Rolle in der physiologischen Zirkulation spielt. Bei Tieren, die über einen Zeitraum von bis zu 4 Jahren nachbeobachtet wurden, wurden nach der ICG-Verabreichung keine Todesfälle oder Veränderungen im Bewegungs- oder Fressverhalten beobachtet.

Die LH-Rate im Ruhezustand variierte zwischen 60 und 122 Schlägen pro Minute (Schläge pro Minute), unterbrochen von Phasen der Asystolie, und stieg nach Injektion von 50 μl Farbstoff auf 72–156 Schläge pro Minute. Jeder LH schlug unabhängig in einem unregelmäßigen Rhythmus und es gab keine Synchronizität zwischen benachbarten ipsilateralen oder kontralateralen LHs. Die Pulsationsraten waren im Allgemeinen in allen LHs ähnlich. Die Injektion von Farbstoff in eine Region führte zu einem gleichzeitigen Anstieg der Rate aller LHs, einschließlich derjenigen, die sich nicht das gleiche Entwässerungsgebiet teilen und keine Farbstoffsammlung aufweisen (Daten nicht gezeigt), was auf eine zentralisierte Steuerung des autonomen Nervensystems schließen lässt.

Ein ellipsoides mathematisches Modell (Abb. 2a) wurde verwendet, um die Ejektionsfraktion (EF) bei UHFUS abzuschätzen und das LH-Herzzeitvolumen (LHO) zu berechnen (Abb. 2b, c). Die mittlere EF betrug 60,40 %, EDV 0,026 mm3, LH-Rate 117,04 bpm, LHO 1,838 mm3/min pro LH und die Gesamtsumme für alle 16 Paare betrug 58,816 mm3/min. Daher sind Molche bemerkenswert in der Lage, alle 1 bis 2 Stunden ein Volumen an Lymphflüssigkeit, das ihrem Körpergewicht von 5 bis 6 g entspricht, mit einer Geschwindigkeit von 10 ml·kg−1·min−1 in den peripheren Venenkreislauf zu pumpen.

Ultrahochfrequenz-Ultraschall-basierte Berechnung des Herzzeitvolumens des molchigen lymphatischen Herzens. (a) Die Struktur des lymphatischen Herzens (LH) besteht aus einer einzelnen Muskelkammer, die Lymphflüssigkeit aus den Lymphkollektoren aufnimmt und diese Flüssigkeit in die Vena lateralis pumpt. Der LH verfügt über ein Eingangsventil und ein Ausgangsventil, die einen Blutrückfluss verhindern. Die computergestützte 3D-Volumenrekonstruktion zeigte, dass die Form des lymphatischen Molchherzens am besten einer ellipsoidähnlichen Form mit einem leicht spitzen Ausgangsende und einem abgeflachten Eingangsende entsprach. Daher wurde die Ejektionsfraktion (EF) mithilfe eines ellipsoiden mathematischen Modells basierend auf 2D-Ultrahoch berechnet Frequenzultraschallmessung des enddiastolischen LH-Volumens (EDV) (b) und des endsystolischen Volumens (c) sowie der LH-Frequenz. Der mittlere EF betrug 60,40 % (SD 12,94), der EDV 0,026 mm3 (SD 0,008) und die mittlere lymphatische Herzfrequenz betrug 117,04 Schläge pro Minute (SD 23,12), was einem LH-Herzzeitvolumen (LHO) von 1,838 mm3/min für jeden LH und a entspricht insgesamt 58,816 mm3/min für alle 16 Paare.

Um die tiefen Lymphnetze zu bewerten, führten wir eine Mikro-CT-Lymphangiographie durch, die den Fluss von Lymphflüssigkeit über die Mittellinie zur kontralateralen Seite des Körpers durch die Rippen, Wirbel und tiefen Wirbellymphgefäße zeigte (Abb. 3a). Wir fuhren fort, die Molch-Mikrozirkulation zu bewerten, um die Lage dieser alternativen Lymphwege mithilfe serieller Schnitte mit computergestützter dreidimensionaler (3D) Volumenrekonstruktion zu bestätigen, die durch Immunhistochemie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) unterstützt wurde. Um die Clearance der roten Blutkörperchen sicherzustellen, den Kollaps der Lumen der Lymphgefäße zu verhindern und für eine verbesserte Fixierung haben wir das Gewebe durch Fixierung mit Perfusion über das Lymphsystem für die Rekonstruktion des vaskulären 3D-Volumens vorbereitet. Die Fixierung durch translymphatische Perfusion nutzte die schnelle Lymphzirkulation, mehrere anatomische lymphatische Venenverbindungen und die spärlichen Venenklappen, die einen bidirektionalen Fluss zu den Kapillarbetten ermöglichen, um den Molch angemessen zu fixieren und einen Kollaps der Lymphgefäße zu verhindern. Urodeles haben 4 Paare großer sammelnder Lymphgefäße, die in Längsrichtung entlang des Rumpfes verlaufen, das TLyLL, das entlang der linken Hälfte verläuft und diese direkt versorgt, Trunci lymphatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) und Trunci lymphatici longitudinales parepigastrici (TLyLPe), die seitlich und ventral verlaufen subkutane Schichten der Rumpfwand bzw. Trunci lymphatici longitudinales subvertebrales (TLyLSv), die größten der vier und tief im Rumpf unmittelbar ventral der Wirbelsäule verlaufen9.

Molch-Mikrozirkulation und das intraossäre Knochenmark-Lymphnetzwerk. (a) Die Mikro-CT-Lymphangiographie zeigte die Bewegung des Kontrastmittels, das in das linke Hinterbein injiziert wurde (rote Pfeilspitze), durch Kollektoren (gelbe Pfeilspitzen) zu den Lymphherzen (links) (grüne Pfeilspitze) und in den Wirbelknochen zu den kontralateralen Kollektoren floss (blaue Pfeilspitze). ), kontralaterale LHs (magentafarbene Pfeilspitzen) und die Trunci lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (weiße Pfeilspitzen). (b) Die funktionelle Lympheinheit wiederholt sich im Rumpf des Molches. Der LH-Eintrag vom oberflächlichen Lymphnetz über das TLyLL und die transversalen intraossären Lymphgefäße (TvIL) verbindet das tiefe Lymphnetz mit dem oberflächlichen Lymphnetz und den LHs auf beiden Seiten des Körpers. (c) und (d) Serienschnitt-Computer-3D-Volumenrekonstruktion mit Darstellung der Lymphgefäße (grün) und Blutgefäße (rot). Die TvIL (gelbe Pfeilspitzen) fließen vom Knochen zu den LHs. Die vorderen LHs des Rumpfes (c) waren enger mit dem angrenzenden Rippenknochen verbunden, während sie im Schwanz (d) durch Skelettmuskeln von den Knochen getrennt waren. (e) und (f) Immunhistochemie, die intraossäre Lymphgefäße und Blutgefäße im Knochenmark des Querfortsatzes einer Bauchrippe (Maßstabsbalken = 100 μm) (e) und des Schwanzwirbels (Maßstabsbalken = 200 μm) (f.) zeigt ). Lymphatische Endothelzellen wurden durch eine hohe Rhodamin-Dextran-Aufnahme und VEGFR-3+-, LYVE-1+-, CD-31+-Färbung identifiziert, während die Endothelzellen der Blutgefäße CD-31+, LYVE-1 ±, VEGFR-3- und niedriges Rhodamin aufwiesen -Dextranaufnahme.

Das Lymphnetzwerk war funktionell in ein oberflächliches dermales und subdermales Netzwerk sowie ein tiefes viszerales Netzwerk mit einigen kleinen Gefäßen organisiert, die die Muskelschicht hauptsächlich in den intermuskulären Septen durchquerten, die die beiden verbindet (Ergänzende Abbildungen iv und v). Das oberflächliche Netzwerk umfasste einen feinen dermalen Lymphplexus, der eng mit den Schleim- und Giftdrüsen der Haut verbunden ist, und einen subdermalen Plexus, der TLyLL, TLyLPab, TLyLPe und die Körpersegmentsammler enthielt. Das tiefe Lymphgefäßnetz umfasste das TLyLSv, den Wirbelplexus der Lymphgefäße und die tiefen Gefäße, die entlang der großen Blutgefäße und Nerven in den intermuskulären Räumen verlaufen, um sich mit den tiefen intraabdominalen und intrathorakalen viszeralen Lymphgefäßen zu verbinden, die schließlich in die Hauptvenen zum Blutherz abfließen. In der Epidermis waren keine Lymphgefäße zu sehen. Ebenso wurden in der Epidermis keine Blutgefäße beobachtet. Stattdessen bildeten die Blutgefäße einen äußerst reichhaltigen, dichten subepidermalen Plexus. Der Muskel verfügte außerdem über ein ausgedehntes Blutgefäßnetz, das die oberflächlichen und tiefen Blutgefäße verband. Der venöse Lateralis (VL), der den LH-Ausstoß erhält, verläuft in der subdermalen Schicht neben dem TLyLL.

Wir fanden heraus, dass das LH zwei Haupteingänge hatte: das TLyLL, das oberflächliche Lymphgefäße sammelt, und ein neuartiges intraossäres Lymphnetz im Knochen, das mit den tiefen Lymphgefäßen TLyLSv verbunden ist (Abb. 3b). Das intraossäre Lymphnetz bestand aus einem Hauptsammellymphgefäß, das wir als transversales intraossäres Lymphgefäß (TvIL) innerhalb der Querfortsätze und Rippen der Wirbel bezeichneten, begleitet von 1 bis 2 Venen, die den VL-LH-Ausgang mit dem von uns so genannten subvertebralen Venenplexus verbinden Dies sind die transversalen intraossären Venen (TvIV) (Abb. 3c, d, Videos 1 und 2). Sowohl TvIL als auch TvIV hatten kleine Äste und Nebenflüsse, die ein Netzwerk im Knochenmark bildeten und mit dem Periost und dem umgebenden Muskel verbunden waren. Die Venen hatten deutlich mehr Nebenflüsse und waren durch das Vorhandensein mehrerer Klappen gekennzeichnet, die den Blutfluss medial zum subvertebralen Venenplexus lenkten. Abgesehen von den beiden Klappen am Eingangs- und Ausgangsende der LHs waren im Lymphgefäßsystem keine weiteren Klappen zu sehen, was einen einfachen bidirektionalen Flüssigkeitsfluss und eine schnelle Reaktion auf Veränderungen in der Lymphzirkulation ermöglichte.

Das Vorhandensein eines funktionellen intraossären Lymphnetzwerks wurde durch die Aufnahme von Rhodamin-Dextran-Farbstoff in VEGFR-3 + -, LYVE-1 + - und CD-31 + -Gefäßen bestätigt (Abb. 3e, f). Die TEM-Analyse (Abb. 4a–d) bestätigte auch die Ultrastruktur der Lymphgefäße im Knochenmark und stellte sie den Blutgefäßen gegenüber25.

Ultrastruktur der intraossären Lymphgefäße und Venen sowie des lymphatischen Herzens. (a) In Harz eingebetteter, mit Toluidinblau gefärbter Scanschnitt einer Molch-Bauchrippe, der die transversalen intraossären Lymphgefäße (TvIL) (b) und die transversalen intraossären Venen (TvIV) (c) im Knochenmark und das angrenzende lymphatische Herz zeigt ( Links) (d). Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte, dass TvIL ((b) Maßstabsbalken = 2 μm) und LH ((d) Maßstabsbalken = 20 μm) von lymphatischen Endothelzellen (LEC) mit den charakteristischen ultrastrukturellen Merkmalen von lymphatischem Endothel ausgekleidet waren, einschließlich der Abwesenheit von Perizyten, dünne Wände und stark abgeschwächtes LEC-Zytoplasma (grüne Pfeilspitzen (b)), mit spärlichen engen Verbindungen, wenigen adhärenten Verbindungen, gelegentlichen Zwischenräumen zwischen LECs (gelbe Pfeilspitzen (b und d')) und überlappenden blattartigen Endothelzellverbindungen (blau). Pfeilspitze (d')). Der spezialisierte LH-Muskel wies charakteristische Merkmale sowohl des Herz- als auch des Skelettmuskels auf (weiße Pfeilspitze (d')). Im Gegensatz dazu waren die TvIV ((c) Maßstabsbalken = 5 μm) von Blutendothelzellen (BEC) ausgekleidet und hatten dickere Wände, umgeben von Perizyten (magentafarbene Pfeilspitzen (c)) mit mehreren Tight Junctions und Adherens Junctions (rote Pfeilspitzen (c). )) und hatte mehrere Zytoplasma-Vesikel. Auch in den Blutgefäßen wurden rote Blutkörperchen beobachtet.

Diese Struktur, bestehend aus den oberflächlichen Lymphsammlern, die Lymphe von den peripheren Körpersegmenten über das TLyLL zu den LHs transportieren, dem TvIL, der Lymphe zwischen den tiefen Lymphgefäßen und den LHs transportiert, und den LHs, die Lymphe in die VL pumpen, bildete die grundlegende funktionelle Lympheinheit entlang des gesamten Rumpfes des Molches wiederholt (Abb. 3b). In den vorderen Lymphgefäßen, die die oberen Gliedmaßen, die Brust und den Bauch entleeren, verläuft das TvIL innerhalb der Rippen und war das größere, vorherrschende Eingangsgefäß des LH, während im Schwanz die oberflächlichen Sammler, die die Hinterbeine und den Schwanz entleeren, vorherrschend waren. Die vorderen LHs (Video 1) waren auch enger an der dorsalen hinteren Seite des angrenzenden Rippenknochens befestigt, während sie im Schwanzbereich (Video 2) etwas weiter von den Knochen entfernt waren und durch einige Skelettmuskeln getrennt waren. Eine serielle Schnittanalyse aller Knochen der Vorder- und Hinterbeine, der Rippen und Wirbel des Halses, des Rumpfes und des proximalen Schwanzes, des Schultergürtels und des Beckengürtels zeigte, dass das Molchknochenmark stark vaskulär, hypozellulär und weitgehend mit Fettgewebe gefüllt war (Ergänzung). Abb. vi und vii).

LHs sind für die Lymphzirkulation in Anuranen unerlässlich13,26,27. Eine experimentelle Unterbrechung ihrer Funktion durch Anästhesie oder Ablation führt bei Fröschen und Kröten innerhalb von 2–4 Tagen zu Hämokonzentration, Ödemen und dem unvermeidlichen Tod13,26,27. Um die unterschiedliche LH-Funktion bei Molchen und Xenopus zu bewerten, führten wir inkrementelle supermikrochirurgische LH-Exzisionen durch. In Übereinstimmung mit früheren Berichten13,26,27 führte die Entfernung der beiden hinteren LH-Paare bei Xenopus zu Ödemen, 18–29 % postoperativer (PO) Gewichtszunahme und Tod innerhalb von 12 Stunden bei allen Fröschen, obwohl intakte vordere LHs vorhanden waren (Ergänzende Abbildung viii). Interessanterweise entwickelte keiner der Molche im Beobachtungszeitraum von einem Monat bis zu einem Jahr nach der LH-Exzision regionaler oder aller 16 LH-Paare Ödeme, Verhaltensänderungen oder starb (Abb. 5a).

Physiologische Veränderungen im Lymphkreislauf nach lymphatischer Herzentfernung. (a) Die Entfernung des Lymphherzens (LH) bei Molchen verursachte weder Ödeme, histologische Veränderungen noch Tod (Maßstabsbalken = 1 mm). Es gab keinen signifikanten Unterschied in den Extremitätendurchmessern 1 Woche nach der Operation (PO) (proximaler t(9) = 0,729, p = 0,485, mittlerer t(9) = − 0,504, p = 0,627, distaler t(9) = 0,297 , p = 0,773) zwischen LH-Exzisionsmolchen und Kontrollen mit guter Interrater-Zuverlässigkeit ICC = 0,893, 95 %-KI (0,825, 0,934). (b) Die Mikro-CT-Lymphangiographie zeigte einen verringerten Lymphkontrast im Blutkreislauf bei LH-Exzisionsmolchen nach 90 Tagen PO, wobei ein Kollateralfluss von Trunci lymphatici longitudinales parabdominales (TLyLPab) zu sehen war (gelbe Pfeilspitzen). Die Analyse der Vena cava posterior (VCP) ergab, dass LH-Exzisionsmolche einen signifikant niedrigeren mittleren Grauwert (t(34) = − 3,156, p = 0,003) aufwiesen als die Kontrollen. (c) Die Rhodamin-Dextran-Fluoreszenz-Lymphangiographie-Analyse des Lymphgefäßes zum Venenfluss (Maßstabsbalken = 100 μm) zeigte ebenfalls eine signifikante Abnahme der Dichte der Blutgefäße, die Lymphflüssigkeit aufnehmen (t(188) = 13,057, p < 0,001) nach 28 Tagen Nach der Entfernung aller LHs normalisierte sich dies jedoch nach 120 Tagen PO (t(161) = − 0,854, p = 0,394). (d) Die Ultrahochfrequenz-Ultraschalluntersuchung zeigte einen signifikanten Anstieg (t(12) = − 2,707, p = 0,019) der LH-Rate bei Molchen, die eine bilaterale hintere LH-Exzision hatten. (e) Der Kollateralfluss hielt die Lymphzirkulation nach Entfernung der LHs aufrecht. TLyLPab-Sicherheiten werden angezeigt (gelbe Pfeilspitzen) mit Verbindungen zum TvIL (magentafarbene Pfeilspitzen). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die LH-Exzision den peripheren Lymphfluss in die Vene für 90 Tage erfolgreich beendete, woraufhin der normale Lymphfluss in die Vene nach 120 Tagen PO wiederhergestellt wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (Fehlerbalken).

Die quantitative Beurteilung des Lymphflusses zu den Venen erfolgte durch quantitative Mikro-CT der Vena cava posterior (VCP) (Abb. 5b) und Messung der Dichte intramuskulärer Blutgefäße, die Rhodamin-Dextran-Farbstoff aus den Lymphgefäßen erhalten hatten (Abb. 5c). Die VCP ist eine Hauptader mit einem gleichmäßigen Verlauf bei Molchen. Im Gegensatz zu anderen großen Venen stellten wir fest, dass die VCP, ähnlich wie die intramuskulären Blutgefäße, nicht von mehreren großen Lymphgefäßen begleitet ist, was sie ideal für die Untersuchung des peripheren Lymphflusses in die Vene macht. Molche mit LH-Exzision hatten nach 28 Tagen PO (p < 0,001) und nach 90 Tagen (p = 0,003) einen signifikant geringeren Lymph-zu-Venen-Fluss, der nach 120 Tagen auf normale Werte anstieg (p = 0,394), was bestätigt, dass die LH-Entfernung den lymphatischen Veneneffekt effektiv beendete Verbindungen und reduzierter Lymph- zu Venenfluss.

Um festzustellen, warum Molche nach der LH-Entfernung keine Symptome einer Lymphfunktionsstörung entwickelten, führten wir nach der Entfernung einiger oder aller LHs eine physiologische Kreislaufuntersuchung durch. UHFUS zeigte, dass die Pumprate der verbleibenden vorderen LHs bei Molchen, bei denen die hinteren LHs herausgeschnitten wurden, signifikant höher war als bei den Kontrollen (Abb. 5d). Diese kompensatorisch erhöhte LH-Aktivität steigerte entsprechend die Leistung jedes LH um 20 %, aber die Gesamtleistung der verbleibenden 9 Paare (41,454 mm3/min) war immer noch niedriger als die Gesamtleistung bei normalen Molchen. Die Mikro-CT-Lymphangiographie von LH-Exzisionsmolchen zeigte die Vergrößerung der kollateralen Lymphgefäße in der subdermalen Ebene, die in Längsrichtung verlaufen und Lymphflüssigkeit zu den TvILs transportieren (Abb. 5b, e).

Um zu bestätigen, ob sich die LHs regenerieren, führten wir nach vollständiger Entfernung einzelner und mehrerer LHs eine serielle mikrochirurgische In-vivo-Dissektion, UHFUS und Mikro-CT-Lymphangiographie durch. Die Regeneration folgte durchweg 5 morphologischen Stadien (Abb. 6a – e). Nach der Auflösung des Gerinnsels wurde erstmals in den ersten 28–60 Tagen PO eine robuste Angiogenese und Wiederherstellung der Struktur der großen Blutgefäße beobachtet (Abb. 6a–e). Es folgte die Lymphangiogenese 50–80 Tage PO (Abb. 6e, f) und die vollständige Regeneration der LHs 100–130 Tage PO (Abb. 6g), wobei die LHs mit dem kaudaleren Schwanz etwas länger brauchten, um sich vollständig zu regenerieren und das Pumpen wieder aufzunehmen mehr Schädelstamm links. Die regenerierten LHs hatten die gleiche Größe, Form, Struktur, Position und Funktion wie die ursprünglichen LHs, einschließlich voll funktionsfähiger Ventile und Strömung, was durch die Aufnahme von Rhodamin-Dextran-Farbstoff gezeigt wurde (Abb. 6g und 7). Die neu regenerierten lymphatischen Endothelzellen (LEC) zeigten eine starke Expression von VEGFR-3, LYVE-1 und CD-31 (Abb. 7).

Morphologische Stadien der lymphatischen Herzregeneration nach vollständiger Exzision. (a) Normales lymphatisches Herz (LH) (magentafarbene Pfeilspitzen) mit seinem versorgenden Nerv (blaue Pfeilspitzen), den Trunci lymphatici longitudinales lateralis (TLyLL) (schwarze Pfeilspitzen) und dem venösen Lateralis (VL) (rote Pfeilspitzen). Die LH-Funktion wurde durch Sammlung von Rhodamin-Dextran bestätigt (Maßstabsbalken = 100 μm). (b) Der Gewebedefekt unmittelbar nach der LH-Exzision. Ein Segment des TLyLL, VL und des versorgenden Nervs, die alle eng mit dem LH verbunden sind, wurde ebenfalls reseziert. (c) Stadium 1 nach der Operation (PO), Tag 5–10: Auf die Gerinnselbildung folgte die Ansammlung einer weichen, fragilen Gewebemasse unter der Wundepidermis. (d) Stadium 2 PO Tag 28–40: Angiogenese mehrerer kleiner Blutgefäße, die die abgeschnittenen Enden des VL und die anderen großen Blutgefäße verbinden. An der Verletzungsstelle wurde keine Lymphangiogenese beobachtet. Die Histologie zeigte regenerierende Muskeln und Fibroblasten, aber keine funktionsfähigen Lymphgefäße und keine Rhodamin-Dextran-Ansammlung. (e) PO-Stufe 3, Tag 50–60: Reifung der Blutgefäße zur Wiederherstellung ihrer ursprünglichen Größe und Struktur sowie Wiederherstellung der VL-Kontinuität. Es wurden kleine Lymphgefäße beobachtet, die von den Wundrändern in Richtung der Verletzungszone sprossen. (f) Stadium 4 PO Tag 80–100: Reifung der Lymphgefäße mit aktivem Fluss und Ansammlung von Farbstoff, beobachtet als zystische Masse im Bereich des ursprünglichen LH, aber keine Pulsationen. (g) Stadium 5 PO Tag 100–130: Vollständige LH-Regeneration mit Pulsation. Die regenerierten LHs hatten voll funktionsfähige Eingangs- und Ausgangsventile und die Aufnahme von Rhodamin-Dextran bestätigte, dass sie voll funktionsfähig waren.

Expression von lymphatischen Endothelzellmarkern in neu regenerierten Lymphgefäßen. Histologische Schnitte, die das regenerierte lymphatische Herz (LH) (gelbe Pfeilspitze) und den angrenzenden Rippenknochen (blaue Pfeilspitze) im Bauchbereich 120 Tage nach der vollständigen mikrochirurgischen Entfernung zeigen. Die neu regenerierten LHs hatten die gleiche Form, Größe, Struktur, Position und Funktion wie die ursprünglichen LHs. Darüber hinaus zeigte das neu regenerierte LH eine starke Expression der lymphatischen Endothelzellmarker VEGFR-3 und LYVE-1 sowie des panendothelialen Markers CD-31. Die Aufnahme des Rhodamin-Dextran-Farbstoffs bestätigte, dass die Lymphgefäße voll funktionsfähig waren (Maßstabsbalken = 200 μm).

Eine randomisierte kontrollierte Studie wurde durchgeführt, um die Funktion der LH-Lymphknoten bei der Regeneration der Gliedmaßen anhand des Hinterbein-Lymphmodells zu bewerten. Bei den untersuchten Molchen wurde eine inkrementelle supermikrochirurgische Entfernung von LH9 bis LH15 und bei den Kontrolltieren eine Scheinoperation mit anschließender Amputation des linken Hinterbeins durchgeführt (Abb. 8a). Die beiden Gruppen hatten eine ähnliche mittlere Schnauzen-Schwanz-Länge, Studiengruppe (101,55 mm, SD 4,57) und Kontrollgruppe (101,97 mm, SD 4,82), t(60) = − 0,352, p = 0,726, und ein ähnliches mittleres Körpergewicht, Studie Gruppe (5,37 g, SD 1,22) und die Kontrollen (5,45 g, SD 1,17) t(60) = − 0,245, p = 0,808. Alle Molche erhielten die vorgeschriebene experimentelle Behandlung. Die Nachbeobachtung war bei 52 Molchen (10 Molche, 4 Studien- und 6 Kontrollmolche) abgeschlossen, die sich nicht vollständig von der Narkose erholen konnten und nach der Operation starben, aber dieser Unterschied war nicht signifikant, p = 0,732. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Zeit, die benötigt wurde, um die einzelnen Regenerationsstadien zwischen den untersuchten Molchen und den Kontrolltieren zu erreichen. Die durchschnittliche Anzahl der Tage bis zum Erreichen des Endpunkts des digitalen Wachstumsstadiums betrug 47,81 Tage (SD 8,56) in der Studiengruppe und 47,52 Tage (SD 10,137) in der Kontrollgruppe, p = 0,773 (Abb. 8b). Eine weitere Untergruppenanalyse zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen einseitiger und beidseitiger LH-Exzision sowie zwischen einer Amputation am selben Tag wie die LH-Exzision und einer um eine Woche verzögerten Amputation (Abb. 8c – i).

Randomisierte Kontrollstudie zur Bewertung des Ergebnisses der lymphatischen Herzentfernung hinsichtlich der Geschwindigkeit und Morphologie der Gliedmaßenregeneration. (a) Das Design der randomisierten Kontrollstudie: n = 62 Molche wurden aufgenommen und in 4 Blöcke aufgeteilt, wobei jeder Block von einem verblindeten unabhängigen Assistenten randomisiert einer Studien- und Kontrollgruppe zugeteilt wurde. Bei 52 Molchen war die Nachuntersuchung abgeschlossen, 10 Molche starben unmittelbar postoperativ. (b) Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Gesamtregenerationsrate zwischen Studien- und Kontrollgruppe (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,662, p = 0,773). (c–h) Die Subgruppenanalyse zeigte auch keinen statistisch signifikanten Unterschied in den Regenerationsraten zwischen Studien- und Kontrollmolchen nach einseitiger LH-Exzision (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,730, p = 0,660), unabhängig vom Zeitpunkt der Amputation unmittelbar nach der LH-Amputation Exzision (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,617, p = 0,841) und Amputation verzögerte sich eine Woche nach LH-Exzision (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,661, p = 0,774). In ähnlicher Weise wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Studien- und Kontrollmolchen nach inkrementeller bilateraler LH-Exzision (Kolmogorov-Smirnov Z = 0,778, p = 0,579) festgestellt, unabhängig vom Zeitpunkt der sofortigen Amputation (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,284, p = 0,074) und Amputation verzögerte sich um eine Woche PO (Kolmogorov-Smirnov Z = 1,193, p = 0,116). (i) Der Vergleich der Molche aus der LH-Exzisionsstudie aus den verschiedenen Versuchschargen (mit Ausnahme der Kontrollen) zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied in der Zeit, die bis zur vollständigen Regeneration benötigt wurde (Kruskal-Wallis H(3) = 0,1,229, p = 0,746). (j) Der Vergleich der morphologischen Anomalien in den regenerierten Gliedmaßen zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,150) zwischen Studien- und Kontrollmolchen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (Fehlerbalken).

Im Vergleich zu den Kontrolltieren entwickelten weniger Molche in der Studiengruppe Anomalien in den regenerierten Gliedmaßen, dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant (Abb. 8j). Die am häufigsten beobachteten Gliedmaßenanomalien waren doppelte Ziffern (n = 6 Molche) und fehlende Ziffern (n = 4 Molche).

Die lymphatisch-rekonstruktive Mikrochirurgie von Lymphödemen hat gezeigt, dass das Lymphgefäßsystem, ähnlich wie die Angiosomen von Blutgefäßen, trotz seiner umfangreichen Verbindungen untereinander in Funktionseinheiten mit spezifischen Lymphsammlern organisiert ist, die vorzugsweise einen spezifischen dreidimensionalen Block des Gewebegebiets, auch bekannt als a, entwässern Lymphosom28,29,30. Die Definition dieser Gebiete ist für das Verständnis der funktionellen Anatomie, der embryologischen Entwicklung, der mikrochirurgischen Behandlung und für die experimentelle Modellierung des Lymphsystems von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie haben wir die funktionelle Lymphanatomie des Molches untersucht und ein neuartiges Lymphnetzwerk im Knochenmark entdeckt, das das oberflächliche und tiefe Lymphnetzwerk verbindet. Mithilfe unseres Modells und unserer Präzisions-Supermikrochirurgie haben wir gezeigt, dass die multiplen LH-Lymphknotenverbindungen, die ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal des Lymph- und Immunsystems von Molchen und anderen hoch regenerationsfähigen Wirbeltieren darstellen (ergänzende Abbildung i), für die Regeneration nicht wesentlich sind. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Molche nach vollständiger Exzision in einem charakteristischen schrittweisen Prozess in der Lage sind, voll funktionsfähiges LH zu regenerieren. Daher stellen Molche ein nützliches Modell für die Untersuchung sowohl der Rolle des Lymphgefäßsystems bei der Regeneration als auch der Regeneration von Lymphgefäßen dar. Allerdings müssen die in dieser Studie festgestellten bemerkenswerten anatomischen Unterschiede zwischen Urodelen, Anuranen und Säugetieren bei der Übersetzung der Ergebnisse berücksichtigt werden.

In der Vergangenheit hinkte die Lymphgefäßforschung derjenigen der Blutgefäße hinterher, da Lymphgefäße im Allgemeinen kleiner sind, ohne Kontrastmittel nur schwer sichtbar sind und viele molekulare Marker mit Blutgefäßen gemeinsam haben, was ihre Unterscheidung vor dem Aufkommen der LEC-Marker Prox-1 erschwerte. VEGFR-3, LYVE-1 und Podoplanin. Panizza war 1883 der erste, der die Lymphgefäße von Salamandern untersuchte, indem er Quecksilber als Kontrastmittel verwendete. Dieses wurde jedoch heftig kritisiert, weil es aufgrund seines Gewichts zu einer Verformung größerer Lymphräume führte, und wurde durch flüssige und halbgelatineartige Farbstoffe ersetzt9,10. Diese Methoden waren für den Einsatz in vivo ungeeignet und gaben wenig Aufschluss über die funktionelle Lymphanatomie. Wir verwendeten ICG NIRF als unsere primäre Modalität, ergänzt durch UHFUS und Mikro-CT-Lymphangiographie, um die Lymphgebiete der Vorderbeine, Hinterbeine und des Schwanzes des Molches in vivo zu definieren, und validierten unser Modell, indem wir nach der LH-Exzision einen verringerten Lymphfluss zu den Venen zeigten. Diese Regionen wurden für die Erstellung von Lymphmodellen ausgewählt, da sie in der Regenerationsforschung am häufigsten verwendet werden. Eine wesentliche Einschränkung von NIRF, die wir sowohl bei Molchen als auch bei Fröschen beobachtet haben, besteht darin, dass ihre dunklen Hautpigmente Licht im nahen Infrarot absorbieren. Daher mussten wir transgene Albino-Tiere verwenden, was in der Folge unsere Probengrößen begrenzte.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich das Lymphsystem der Urodele erheblich vom Lymphsystem der Anurane unterscheidet. Obwohl die 60,40 % EF, die wir bei Molch-LHs fanden, mit den 20 bis 80 % vergleichbar waren, die bei Anuranen berichtet wurden, zeigten Molch-LH-Raten und EF keine große Variation mit dem Wachsamkeitszustand des Tieres26,31. Die daraus resultierende Gesamtleistung aller 16 LH-Paare in Molchen von 10 ml.Kg-1 min-1 war ebenfalls doppelt so hoch wie die geschätzten 0,9–5 ml.Kg-1 min-1, die durch alle Anuran-LHs flossen26. Paradoxerweise führten im Gegensatz zu Anuranen weder eine vollständige Vollnarkose noch die vollständige Entfernung einiger oder aller LHs bei den Molchen zu einer lymphatischen Dysfunktion oder zum Tod, stattdessen wurde der Kollateralfluss schnell mobilisiert und die Durchblutung wiederhergestellt. Diese Rekrutierung von Kollateralen nach Unterbrechung einiger wichtiger Lymphsammler wird von den meisten anderen Wirbeltieren mit Ausnahme von Anuranen übernommen. In dieser Hinsicht weist das Lymphsystem der Urodele anatomisch mehr Ähnlichkeiten mit anderen Wirbeltierklassen auf als das der erwachsenen Anurane. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Molche nicht über die großen subkutanen Lymphsäcke verfügen, die für erwachsene Anurane charakteristisch sind10,32. Das Ergebnis der einzigartigen Biologie von Anuranen bedeutet, dass ihr Lymphfluss für den Fluss der peripheren Lymphe in die Lymphsäcke in hohem Maße von Muskelbewegung und Lungenventilation abhängt und dass sie für den Abfluss der Lymphe in den Blutkreislauf gleichermaßen von ihren LHs abhängig sind. Somit stellt das Anuran-Lymphsystem eine hochspezialisierte Ablenkungsanpassung dar, um den einzigartigen Bedürfnissen der Anuran-Körperarchitektur gerecht zu werden, und nicht das ausschließliche Amphibienmodell des evolutionären Fortschritts.

Bemerkenswerterweise identifizierten wir ein neuartiges intraossäres Netzwerk von Lymphgefäßen im Knochenmark normaler Molche, das das oberflächliche Lymphnetz, den größeren tiefen Plexus vertebralis und die LHs verbindet. Der bevorzugte Durchgang dieser Gefäße durch die Knochenhöhle bietet einen mechanischen Schutz gegen den Kollaps des Gefäßlumens. Dieses ausgedehnte Netzwerk hielt die Lymphzirkulation auch nach der Entfernung aller LHs aufrecht und verhinderte so eine lymphatische Dysfunktion bei Molchen. Insbesondere konnten wir die Prox-1-Expression trotz mehrerer Versuche unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen nicht zur Identifizierung von LECs nutzen. Aus diesem Grund haben wir einen multimodalen Ansatz gewählt, der die 3D-Rekonstruktion serieller Schnitte mit der Mikro-CT-Lymphangiographie kombiniert, die durch Endothelzell-VEGRF-3- und LYVE-1-Expressionsanalyse, TRITC-Dextran-Farbstoffinjektionsstudien und TEM-Analyse unterstützt wird, um das Vorhandensein eines Lymphgefäßes umfassend nachzuweisen Netzwerk in den Wirbelknochen und Rippenknochen (Abb. 3 und 4). Allerdings ist weiterhin eine Prox-1-Färbung erforderlich, um die lymphatische Identität der VEGFR-3+- und LYVE-1+-Gefäße in den Wirbel-, Rippen- und Röhrenknochen endgültig nachzuweisen (ergänzende Abbildung v).

Obwohl es sich bei vielen Wirbeltieren um ein wichtiges primäres lymphoides Organ des Lymphsystems handelt, wurden Lymphgefäße im Knochen nur bei Krankheitszuständen wie vaskulären Knochentumoren und ausgedehnten primären und sekundären bösartigen Knochentumoren identifiziert33,34,35. Die Knochenaversion von Säugetieren gegenüber Lymphgefäßen wird am deutlichsten bei der Gorham-Stout-Krankheit deutlich, einer kaum verstandenen Erkrankung, die durch das Auftreten von Lymphgefäßen im Knochen gekennzeichnet ist, was zu einer äußerst destruktiven und fortschreitenden Knochenresorption führt, die zum vollständigen Verschwinden des betroffenen Knochens führt36. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der erwachsene Molchknochen trotz des Vorhandenseins von Lymphgefäßen weder ein primäres noch ein sekundäres lymphoides Organ ist37,38, sondern stattdessen als wichtiges Lymphdrainageorgan und Fettreservoir bei Molchen fungiert. Wir spekulieren, dass die Lymphgefäße zusätzlich am Stoffwechsel und der Mobilisierung dieses Fettspeichers im Knochenmark beteiligt sein könnten.

Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem ist die Rolle des adaptiven Immunsystems bei der Regeneration von Molchen kaum bekannt. Analysen von scRNA-seq in Axolotl haben konsistent die T- und B-Zellmarker tac und igll5 in kritischen Stadien der Gliedmaßenregeneration identifiziert39,40,41. Unser Ergebnis, das keine signifikanten Veränderungen in der Regeneration nach der Entfernung wichtiger Komponenten des Gefäßsystems des Molch-Lymphsystems zeigt und mit früheren Berichten über die Entfernung des größten sekundären lymphatischen Organs, der Milz, übereinstimmt, lässt jedoch stark darauf schließen, dass die adaptive Immunantwort für die Regeneration nicht wesentlich ist kann aber stattdessen auch eine regulierende Rolle haben42.

Lymphödeme sind die direkte Folge einer beeinträchtigten Funktion der Lymphgefäße. Die genauen Mechanismen hinter dem Scheitern der Lymphregeneration nach einer Verletzung durch Operation und Radiochemotherapie sind weiterhin unbekannt43. TGF-β1-vermittelte Narbenbildung und Fibrose sowie Sklerose und Verlust der Pumpaktivität der sammelnden Lymphgefäße gelten als auslösende Schritte in der Pathophysiologie von Lymphödemen43,44. Abgesehen vom LH fehlen den Lymphgefäßen der Amphibien sowohl die muskulös pulsierenden Wände als auch die Ventile, die man bei sammelnden Lymphgefäßen von Säugetieren findet45. Diese Eigenschaft macht LHs ideal für die Modellierung der strukturellen und funktionellen Aspekte menschlicher Lymphgefäße. Bemerkenswert ist, dass die LH-Muskulatur des Molches im Gegensatz zur glatten Muskulatur von Säugetiersammlern die Eigenschaften der Skelett- und Herzmuskulatur aufweist13,46. Wir haben gezeigt, dass Molche nach vollständiger Exzision in der Lage sind, LH zu regenerieren. Die hohe Expression von VEGFR-3 in den neu regenerierten LECs legt nahe, dass die Lymphregeneration bei Molchen wie bei Säugetieren möglicherweise auch vom VEGF-C/VEGFR-3-Weg abhängt47. Wir spekulieren, dass eine Schädigung der Nervenversorgung der Grund dafür sein könnte, dass die kaudaleren LHs die Wiederaufnahme der Pumpaktivität verzögerten. Studien an Fröschen zeigten, dass es nach der Denervierung 20 bis 30 Tage dauert, bis sich das LH-Pumpen erholt46. Die beobachtete Regeneration der Blutgefäße vor den Lymphgefäßen erinnert an die embryonale Entwicklung von Prox-1-exprimierenden Lymphgefäßen, die aus Blutgefäßen sprießen48,49. Zukünftige Studien sollten sich auf die Quelle der LECs in den regenerierenden LHs, die unterschiedliche räumlich-zeitliche Expression von Prox-1, LYVE-1, VEGFR-3, SOX18 und anderen mit der Lymphangiogenese verbundenen Faktoren sowie auf die Faktoren konzentrieren, die die vollständige Genesung beeinflussen der Pumpaktivität.

Klinisch wird die mikrochirurgische Schaffung einer lymphatisch-venösen Anastomose (LVA) entweder allein oder als efferente LVA bei vaskularisierten Lymphknotentransfers heute weithin als die wichtigste chirurgische Behandlung von Lymphödemen und Lymphflussstörungen angesehen50,51,52,53. Diese funktionieren ähnlich wie die natürlichen LH-Lymphknotenverbindungen von Molchen. Daher haben wir unsere Studie auf diese Zusammenhänge konzentriert, da sie eine leicht zugängliche Möglichkeit zur chirurgischen Umsetzung möglicher therapeutischer Vorteile bei Patienten über die Flüssigkeitszirkulation hinaus darstellen. Der in dieser Studie festgestellte fehlende Zusammenhang zwischen lymphatischen und venösen Verbindungen mit der Regeneration bietet vorläufige Einblicke in die Biologie des heilenden Gewebes nach LVA. Die enge Verbindung der LH-Lymphknoten bei Molchen mit den intraossären Knochenlymphgefäßen, die beim Menschen natürlicherweise fehlen, ist jedoch eine konsequente Erinnerung an die Unterschiede in der Lymphphysiologie zwischen Molchen und Menschen. Die Untersuchung der immunologischen und metabolischen Funktionen dieses intraossären Lymphnetzwerks könnte Aufschluss über das evolutionäre Fehlen von Lymphgefäßen im menschlichen Knochen, ihre Rolle bei Krankheiten, Immunität, Fettstoffwechsel und möglicherweise bei der Regeneration geben.

Wildtyp- und transgene Albino-ausgewachsene japanische Feuerbauchmolche (Cynops pyrrhogaster) mit einer Schnauze-Schwanz-Länge von 90 bis 120 mm wurden von der Fakultät für Lebens- und Umweltwissenschaften der Universität Tsukuba erhalten54. Der südafrikanische Wildtyp- und Albino-Klauenfrosch Xenopus Laevis wurde in einer örtlichen Zoohandlung erworben. Wildtyp-Molche und alle Frösche wurden in der Abteilung für Plastische Chirurgie der Mie-Universität untergebracht, während die Albino-Molche in der Fakultät für Lebens- und Umweltwissenschaften der Tsukuba-Universität untergebracht wurden. Alle Experimente mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Animal Care Committee der Mie University und dem Animal Care and Use Committee der University of Tsukuba Approval (Registrierungscode 170110) genehmigt wurden. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien 2.055 durchgeführt und berichtet.

Die Tiere erhielten vor den Versuchsdurchgängen 1–2 Stunden lang eine Anästhesie mit 0,1 %iger FA100-Lösung (4-Allyl-2-methoxyphenol; DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan) in Wasser bei Raumtemperatur56.

Die ICG-NIRF-Lymphangiographie wurde an transgenen Albinomolchen54 (n = 9 Molchen) und Albinofröschen (n = 3 Fröschen) durchgeführt. Zur Beurteilung des Lymphflusses unter normalen physiologischen Bedingungen wurde eine subkutane Injektion von 10–20 μl einer 1:1000-Lösung Diagnogreen 25 mg/ml (Daiichi Sankyo, Tokio, Japan), verdünnt mit sterilem Wasser zur Injektion, verwendet, um den Lymphfluss unter normalen physiologischen Bedingungen zu bewerten Wird verwendet, um den Abfluss überschüssiger Gewebeflüssigkeit zu beurteilen. Die Injektionen der dorsalen und ventralen Flächen der Hand (Vorderbein) und des Fußes (Hinterbein) sowie der linken und rechten Seite der distalen 10–15 mm des Schwanzes wurden jeweils separat beurteilt. Der Lymphfluss wurde mit einer PDE Neo NIRF-Kamera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan) bei hoher Vergrößerung im Abstand von 15–25 cm von den Tieren visualisiert und aufgezeichnet.

Die Immunhistochemie wurde wie zuvor von Casco-Robles et al.57 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, die Proben wurden jeweils 15 Minuten lang in PBS, 0,2 % TritonX-100 in PBS und erneut in PBS gewaschen und in Blockierungslösung (2 % normales Ziegenserum (S-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)/0,2 % inkubiert % TritonX-100 in PBS) für 2 Stunden, gewaschen wie zuvor und dann in primärem Antikörper, verdünnt in Blockierungslösung, inkubiert. Für die VEGFR-3-Färbung wurde tTBS anstelle von PBS verwendet. Fluoreszenzfarbstoffstudien wurden unter Verwendung von Tetramethylrhodamin-Dextran mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 (Invitrogen D-7139) durchgeführt, das in sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert wurde, wobei 20–50 μl subkutan injiziert und 10–15 Minuten später Gewebeproben entnommen wurden. Lymphgefäße wurden identifiziert und von Blutgefäßen unterschieden, indem die unterschiedliche Rhodamin-Dextran-Aufnahme und die unterschiedliche Färbung von VEGFR-3, LYVE-1 und CD-31 verglichen wurden. LECs wurden als VEGFR-3 + , LYVE-1 + , CD-31 + und BEC als CD-31 + , LYVE-1 ± , VEGFR-3- identifiziert. Eine zusätzliche Identifizierung von Lymphgefäßen durch Färbung mit kommerziell erhältlichen Prox-1-Antikörpern in ausgewachsenen erwachsenen Molchen wurde unter verschiedenen Versuchsbedingungen versucht, war jedoch erfolglos (Daten nicht gezeigt). Histologische Bilder wurden mit einem Keyence BZ-X710-Mikroskop und einer Olympus AX80 in Verbindung mit einer Olympus DP74-Mikroskop-Digitalkamera aufgenommen. Die Bildverarbeitung wurde mit Image J58,59 durchgeführt.

Die folgenden Antikörper wurden gekauft: Anti-LYVE-1 Novus (NB600-1008), Anti-CD-31 Bioss (BS-0195R), Anti-LYVE-1 Abcam (Ab14917). Der Anti-VEGFR-3-Antikörper wurde von Eurofins Japan speziell auf der Grundlage des Newt-Nukleotid-Orthologs hergestellt. Weitere Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern finden Sie in den ergänzenden Daten.

Nach der Anästhesie wurden 50 μl ICG-Farbstoff subkutan in die Gliedmaßen oder den Schwanz der Molche und Frösche injiziert. Am Rücken wurde mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 15 ein Hautlängsschnitt unmittelbar unterhalb der Seitenlinienleiste über den zu entfernenden LHs vorgenommen und ein 2–3 mm breiter Hautlappen in der Subdermalebene unter Verwendung der supermikrochirurgischen Dissektionstechnik und OMS angehoben 800- und OMS 610A-Operationsmikroskope (Topcon, Tokio, Japan) zur Erhaltung von Hautblutgefäßperforatoren. Die LHs wurden visuell durch Pulsationen und Sammlung von ICG-Farbstoff identifiziert. LH wurden mithilfe supermikrochirurgischer Technik und supermikrochirurgischer Titaninstrumente (EMI Factory CO., Ltd. Nagano, Japan) herausgeschnitten, um das umliegende Gewebe in der Studiengruppe sorgfältig zu erhalten, während in der Kontrollgruppe eine identische Operation durchgeführt wurde, die LHs jedoch intakt blieben. Die Hautlappen wurden mit Einzelknopfnähten aus Nylon 10/0 verschlossen.

Insgesamt 62 Molche wurden in die randomisierte Kontrollstudie aufgenommen und in 4 Blöcke aufgeteilt, um die Regeneration nach inkrementeller LH-Exzision und die Regeneration nach dem Einsetzen von Kreislaufveränderungen nach 1 Woche PO zu bewerten. Die Molche wurden dann mithilfe von SPSS 26 durch einen verblindeten und unabhängigen Assistenten (von der HPB-Chirurgieabteilung) in ungefähr gleiche Versuchsgruppen randomisiert. Unabhängige T-Tests wurden verwendet, um die mittlere Schnauzen-Schwanz-Länge und das mittlere Gewicht der beiden Gruppen zu vergleichen. Die 7 LHs, die die unteren Extremitäten entleeren, wurden bei allen Molchen identifiziert und mithilfe der oben beschriebenen supermikrochirurgischen Technik in der Studiengruppe herausgeschnitten, während bei den Kontrollpersonen eine identische Dissektion durchgeführt wurde, die LHs jedoch intakt blieben. Das linke Hinterbein wurde 2 mm proximal des Kniegelenks mit einem chirurgischen Skalpell Nr. 10 amputiert und der hervorstehende Femur bündig mit der Wunde abgeschnitten. Um eine Blutstillung zu erreichen, wurde einige Minuten lang sanfter Druck ausgeübt. Eine Verblindung der Untersucher war aufgrund des chirurgischen Charakters der experimentellen Behandlung nicht möglich. Um eine Verzerrung zu begrenzen, wurde die zugewiesene Gruppe den Mikrochirurgen jedoch erst nach Wundfreilegung und lymphatischer Mikrodissektion bekannt gegeben. Die Molche wurden ungefüttert in separaten Plastikbehältern bei Raumtemperatur gehalten, täglich beobachtet und das morphologische Stadium der Regeneration aufgezeichnet60. Unser ursprüngliches Protokoll sah die Beurteilung der Regenerationszeit der Gliedmaßen durch drei verblindete Forscher vor. Aufgrund der begrenzten Personalverfügbarkeit zwischen 2020 und 2021 sind wir jedoch vom Protokoll abgewichen und haben diese Bewertung stattdessen von einem einzigen, nicht verblindeten Prüfer durchgeführt. Die Regenerationsrate wurde zwischen Studien- und Kontrollgruppen mithilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests mit zwei Stichproben verglichen. Der Kruskal-Wallis-Test wurde für die Subgruppenanalyse der Studiengruppe LH-Exzisionsmolche verwendet. Die Beurteilung der Morphologie der regenerierten Gliedmaßen wurde von zwei verblindeten Untersuchern durchgeführt. Der Fisher Exact Test wurde verwendet, um die Anteile morphologisch anomaler regenerierter Gliedmaßen und PO-Todesfälle zu vergleichen.

Bei Molchen (n = 6 Molche der Studiengruppe, n = 5 Kontrollmolche) wurde der Durchmesser des linken Hinterbeins an 3 Punkten gemessen; 3 mm proximal des Sprunggelenks, am Kniegelenk und im Oberschenkel 2 mm proximal des Knies 1 Woche nach LH-Exzision durch 2 unabhängige, verblindete Assistenten. Der klasseninterne Korrelationskoeffizient wurde auf der Grundlage eines 2-Wege-Mischeffektmodells mit mittlerer Bewertung (k = 2) und absoluter Übereinstimmung berechnet. Bei Fröschen (n = 2 Frösche) wurden die Frösche mit einem Papiertuch trocken getupft, um überschüssiges Wasser zu entfernen, und das Gesamtkörpergewicht wurde mit einer digitalen Mikrowaage gemessen.

Die Dichte der Rhodamin-Dextran-positiven intramuskulären Gefäße wurde durch Zählen der Anzahl der Gefäße in einem 20-fachen Feld an 24 bis 36 verschiedenen Paraffinquerschnitten der Schwanzbasis, des Bauches und der Brust jedes Molches bestimmt. N = 3 Molche wurden 28 Tage nach der Entfernung aller LHs untersucht, n = 1 Molche wurden nach 120 Tagen untersucht und n = 3 Kontrollmolche 28 Tage und 120 Tage nach einer Scheinoperation. Zum Vergleich der Gefäßdichten zwischen den Gruppen wurden unabhängige T-Tests verwendet.

Die Mikro-CT-Lymphangiographie wurde mit CosmoScan GXII (Rigaku, Tokio, Japan) vor und 10–60 Minuten nach der subkutanen Injektion von 10–50 μl Iohexol (Omnipaque®300, GE Healthcare Pharma, Tokio, Japan) durchgeführt und die Bilder mit RadiAnt verarbeitet DICOM Viewer-Software. Die quantitative Analyse des VCP wurde mit Bild J59 durchgeführt. Der mittlere Grauwert des VCP-Querschnitts wurde an 6 verschiedenen Punkten entlang seines Verlaufs vom Becken zur Leber bei jedem Molch gemessen und ein unabhängiger T-Test zum Vergleich von Studie (n = 3 Molche) und Kontrolle (n = 3 Molche) Gruppen.

UHFUS wurde an 6 Molchen (n = 2 normale Molche, n = 2 LH-Resektionsmolche, n = 2 Kontrollmolche) unter Verwendung von VeVo MD UHF70 (FUJIFILM Visualsonics, FUJIFILM, Tokio, Japan) vor und nach der Injektion von 20–50 μl durchgeführt Kochsalzlösung in die Gliedmaßen. Zur Berechnung von LH EF wurden insgesamt n = 8 LH von 2 Molchen verwendet. Insgesamt wurden n = 3 LH von 2 Studienmolchen und n = 11 LH von 1 Kontrollmolch und 2 normalen Molchen zum Vergleich der LH-Ratenkompensation nach Entfernung des hinteren LH unter Verwendung eines unabhängigen T-Tests verwendet.

Für eine einzelne LH-Exzision (n = 5 Molche) wurde ein 2 × 4 × 2 mm großer Hautlappen im proximalen Schwanz angehoben und ein einzelnes LH mit der oben beschriebenen supermikrochirurgischen Technik herausgeschnitten. Die Regeneration wurde beurteilt, indem der Hautlappen 150 Tage lang in wöchentlichen und dann monatlichen Abständen geöffnet wurde. Bei der mehrfachen LH-Exzision wurden n = 1 Molch nach der Exzision aller 16 LH-Paare und n = 16 Molche der Studiengruppe aus dem Gliedmaßenregenerationsexperiment nach 100 bis 150 Tagen durch Öffnen von Hautlappen entlang des Bereichs, in dem die LH entfernt wurden, beobachtet mittels Mikro-CT-Lymphangiographie. Tetramethylrhodamin-Dextran-Lymphangiographie und IHC wurden an seriellen histologischen Schnitten nach 28 Tagen (n = 3 Molchen) und 120 Tagen (n = 1 Molchen) durchgeführt.

FixLyP wurde durchgeführt, um die roten Blutkörperchen aus den Blutgefäßen zu entfernen und die Lymphgefäße zu fixieren, um deren Kollaps zu verhindern, als Vorbereitung für die computergestützte 3D-Volumenrekonstruktion von Serienobjektträgern. Es wurde ein Hautschnitt in der Mittellinie des Abdomens vorgenommen, wobei darauf geachtet wurde, nicht in das Peritoneum einzudringen. Der VCP (Durchmesser 0,3–0,5 mm) wurde mithilfe eines Operationsmikroskops identifiziert, während er vom Becken in die Leber unmittelbar tief zum Peritoneum aufsteigt. Das Peritoneum wurde geöffnet, proximal und distal kleine mikrovaskuläre Klammern angebracht und die Vene 5 mm vor ihrem Eintritt in die Leber durchtrennt. Das kephale Ende der Vene wurde mit mikrochirurgischer Standardtechnik präpariert, um die Adventitia abzutrennen. Anschließend wurde eine mikrovaskuläre, stumpfe Gefäßnadel mit runder Spitze in das kephale Ende der Vene eingeführt und die Gefäßklemmen gelöst. Mit einer 1-ml-Spritze wurde langsam 4 °C kalte Heparin-Kochsalzlösung in die Vene injiziert, so dass das kaudale Ende der Vene frei bluten konnte, bis die Leber weißlich wurde und klare Heparin-Kochsalzlösung austrat. Als nächstes wurde kaltes 4 %iges Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C langsam mit 20–50 μl/Körpergewicht (g)/min in das Unterhautgewebe der Gliedmaßen und des Schwanzes injiziert, bis der Körper des Molches steif wurde. Anschließend wurden Proben gesammelt und sofort für 4 Stunden in kaltes 4 %iges PFA gegeben und anschließend 2 Tage lang mit EDTA demineralisiert.

In Paraffin eingebettete Serienschnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden mit HE angefärbt und mit 20 × unter Verwendung eines NanoZoomer S360 Digital-Objektträgerscanners (Hamamatsu Photonics K. K., Hamamatsu, JAPAN) gescannt. Die digitale 3D-Computervolumenrekonstruktion von 900 seriellen Dias des Abdomens und des Schwanzes wurde mit dem Image J (FiJi Version 1.53f51) TrakEM2-Plugin58,59 durchgeführt. In Fällen, in denen ein Gewebeschnitt durch Präparationsartefakte stark verzerrt oder beschädigt war, wurde das Bild aus dem Stapel ausgeschlossen und das am besten passende angrenzende Bild dupliziert, um das Gewebevolumen beizubehalten. Lymphgefäße wurden retrograd verfolgt und markiert, während Blutgefäße antegrad von den LHs markiert wurden (ergänzende Abbildung iv).

Die Proben wurden 2 Stunden lang bei 4 °C in 2,5 % Glutaraldehyd vorfixiert, dann mit K-CX (Falma, Tokio, Japan) demineralisiert, 10 Minuten lang dreimal in PBS gewaschen und 1 Stunde lang in 1 % OsO4 nachfixiert. Das Waschen mit PBS wurde zweimal 15 Minuten lang wiederholt, und die Probe wurde in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol dehydriert und dann in Aceton überführt. Die Proben wurden infiltriert und anschließend in Epoxidharz eingebettet. Mit Toluidinblau gefärbte serielle 400-μm-Scanschnitte wurden für die Lichtmikroskopie vorbereitet und 80-nm-Schnitte für die Transmissionselektronenmikroskopie geschnitten und dann mit einem JEM-1400Flash-Elektronenmikroskop (JEOL, Tokio, Japan) betrachtet.

Die Analysen wurden mit SPSS 26 (IBM Corp. veröffentlicht 2019. Armonk, NY) und SPSS 27 (IBM Corp. veröffentlicht 2020. Armonk, NY) durchgeführt. Bei allen durchgeführten statistischen Tests handelte es sich um zweiseitige Tests mit p < 0,05, die als statistisch signifikant angesehen wurden.

Präsentiert auf der 31. jährlichen Wissenschaftlichen Konferenz für Plastische Chirurgie der Universität Tokio im Januar 2020 in Tokio, Japan.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Endothelzellen der Blutgefäße

Indocyaningrün

Nahinfrarot-Fluoroskopie-Lymphangiographie

Lymphatische Endothelzelle

Lymphatisches Herz

Ultrahochfrequenz-Ultraschall

Seitliche longitudinale Lymphstämme

Paraabdominale longitudinale Lymphstämme

Parepigastrische longitudinale Lymphstämme

Subvertebrale Lymphstämme in Längsrichtung

Transversale intraossäre Lymphgefäße der Wirbel

Quere intraossäre Wirbelvenen

Hintere Hohlvene

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Diese Arbeit wurde durch KAKENHI-Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science finanziert (Zuschussnummern: 21K09764 und 18H04061). Wir möchten Frau Kiku Shinano herzlich für die allgemeine administrative Unterstützung danken und Dr. Jackson Chipaila, Prof. Taizo Shiraishi, Dr. Takahara Iino und Frau Miyuki Namikata für die Unterstützung bei den Experimenten.

Diese Arbeit wurde durch KAKENHI-Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science finanziert (Zuschussnummern: 21K09764 und 18H04061).

Abteilung für Plastische und Rekonstruktive Chirurgie, Graduate School of Medicine, Universität Mie, 2-174 Edobashi, Tsu, Präfektur Mie, 514-8507, Japan

Chihena H. Banda, Makoto Shiraishi, Kohei Mitsui, Yoshimoto Okada, Kanako Danno, Ryohei Ishiura, Kaho Maemura und Mitsunaga Narushima

Fakultät für Lebens- und Umweltwissenschaften, Universität Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Präfektur Ibaraki, 305-8571, Japan

Chikafumi Chiba

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CHB, MS, MN, CC und Ko.M. hat die Studie entworfen. CHB, MS, MN, YO, KD, RI, Kah.M. und CC führte die Datenerfassung durch. CHB, MS, MN, Ka.M und CC waren an der Analyse und Interpretation der Daten beteiligt. CHB hat das Manuskript entworfen und MS, RI, MN, YO, KD, Ko.M., Ka.M., KIY, AM, CC haben das Manuskript überarbeitet. Alle aufgeführten Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt und sich bereit erklärt, persönlich für den Inhalt dieser Studie verantwortlich zu sein.

Korrespondenz mit Mitsunaga Narushima.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Banda, CH, Shiraishi, M., Mitsui, K. et al. Strukturelle und funktionelle Analyse des Molch-Lymphsystems. Sci Rep 13, 6902 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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Eingegangen: 19. Dezember 2022

Angenommen: 25. April 2023

Veröffentlicht: 27. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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